禽流感血凝抑制试验检测方法技术

本发明专利技术公开了一种禽流感血凝抑制试验检测方法，包括以下步骤：S1、将V形微量反应板顺序编号第1孔至第12孔，从第1‑11孔依次向各孔加入50μL4单位禽流感病毒抗原液；S2、在第1孔和第12孔中分别加入50μL被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μL；S3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL 1％的鸡红细胞悬液；S4、将V形微量反应板置于微量振荡器上振荡，静置孵育，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况。本发明专利技术的检测方法高效、快捷、准确度高，适合企业对大规模鸡群的监测。

【技术实现步骤摘要】
禽流感血凝抑制试验检测方法
本专利技术涉及微生物检测领域，具体是一种禽流感血凝抑制试验检测方法。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，可以感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属。血凝(直接血凝)反应是利用病毒或病毒的血凝素能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1％红细胞悬液与待测血清及病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。禽流感血凝抑制试验是进行抗体检测的重要手段，可以对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划。由于禽流感血凝抑制试验需要采集新鲜血液，因此对于其中涉及的试验原料及试剂的量均很小，在试剂量小的前提下能够精确测定是试验成功的关键，国家标准检测方法需要用生理盐水对待测血清进行稀释，过程中需要进行多次孵育，步骤繁琐，耗费时间，多个步骤环环相扣，误差增幅大，精确测定的风险增大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种禽流感血凝抑制试验检测方法，本专利技术优化了国标禽流感血凝抑制实验的检测方法，直接用4单位的病毒液稀释血清，可以更快速地对免疫鸡群进行抗体监测。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种禽流感血凝抑制试验检测方法，包括以下步骤：S1、取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL4单位禽流感病毒抗原液；S2、在第1孔及第12孔中分别加入50μL被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μL；S3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液。优选的是，还包括：S4、将V形微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况，并得到被检血清的血清效价。优选的是，步骤S4中的凝集情况包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集时的被检血清的最大稀释度为该被检血清的HI滴度，即血清效价。优选的是，步骤S2中的4单位禽流感病毒抗原液的制备方法具体为：a、另取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL生理盐水；b、在第1孔加入50μL禽流感病毒液，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，第11孔弃去50μL；c、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液；d、将微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，在第1孔至第12孔中出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底的性状时，以出现该性状的所有孔所对应的禽流感病毒液的最大稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即一个凝集单位，从而计算出4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度，根据4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度配制4单位禽流感病毒抗原液。优选的是，步骤S1中、及步骤a中的V形微量反应板均为96孔V形微量反应板。优选的是，步骤S2中的被检血清使用前置于56℃水浴中恒温灭活30min。优选的是，步骤S3中鸡红细胞悬液通过以下方法获得：首先采集5只SPF成年公鸡的血液各0.5mL，并加入1mL抗凝剂混合均匀后，吸取2mL置于圆底离心管中，加入15mL质量分数为0.9％的生理盐水进行一次离心，其时间为12min、转速为1000r/min，弃去上清液，再加入15mL所述生理盐水进行二次离心，其时间为8min、转速为1500r/min，弃去上清液，再加入15mL所述生理盐水进行三次离心，其时间为5min、转速为1800r/min，弃去上清液，然后，加入8mL的PBS缓冲溶液离心后弃去上清液，反复进行三次，每次离心的时间为2min，转速为500r/min，最后，吸取圆底离心管底部的红细胞1mL，加入到99mL的PBS缓冲溶液中，轻微震荡摇匀，得到体积分数为1％的鸡红细胞悬液，其中，所用的PBS缓冲溶液的pH为7.0。优选的是，步骤S1和步骤a中所用的96孔V形微量反应板在使用前均经过如下处理：将微量反应板先置于质量分数为1％的稀盐酸中浸泡12h，取出经蒸馏水冲洗后，再依次置于质量分数为50％的乙醇中浸泡6h、蒸馏水中浸泡1h，取出后置于超声波清洗机中超声清洗，同时用紫外灯进行间歇性照射，最后烘干即可，其中，超声波频率为25～30KHz，时间为30min，紫外灯的波长为260nm，间歇性照射具体是照射时间为210s与停止照射时间为90s交替进行。优选的是，所述抗凝剂为柠檬酸钠与肝素以质量比为1:2混合而成。优选的是，烘干时的温度为110℃。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术通过测定被检血清的效价的高低，可以监测被检血清中的抗体水平，对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划，确保养殖生产的顺利进行。本专利技术的检测方法高效、快捷、准确度高，减少孵育次数，节约时间、材料和人力成本，适合企业对大规模鸡群的监测。本专利技术通过多次不同的离心得到的鸡红细胞悬液的红细胞纯度更纯、无自拧现象，用于血凝抑制试验检测时不干扰被检血清中的抗体，与禽流感病毒抗原液反应灵敏，现象清晰，同时本专利技术对V形微量反应板进行彻底清洗，尤其在用超声波处理的同时用紫外灯间歇照射，超声波清洗机的震动使其内部的水跟随震动，紫外灯照射水后发生折射，使紫外线从多个方向射到V形微量反应板上，并射入V形微量反应板的微小的孔中，彻底杀菌，确保V形微量反应板的清洁无菌，避免因V形微量反应板携带杂质而影响血凝抑制试验的结果，导致监测有误，影响养殖生产。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。<实施例1>首先，配制4单位禽流感病毒抗原液，具体方法为：a、取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL生理盐水；b、在第1孔加入50μL禽流感病毒液，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，第11孔弃去50μL；c、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液，并将第12孔设为红细胞对照。d、将微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，在第1孔至第12孔中出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底的性状时，以出现该性状的所有孔所对应的禽流感病毒液的最大稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即一个凝集单位，从而计算出4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度，根据4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽流感血凝抑制试验检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL4单位禽流感病毒抗原液；S2、在第1孔及第12孔中分别加入50μL被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μL；S3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液。

【技术特征摘要】
1.一种禽流感血凝抑制试验检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL4单位禽流感病毒抗原液；S2、在第1孔及第12孔中分别加入50μL被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μL；S3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液。2.如权利要求1所述的禽流感血凝抑制试验检测方法，其特征在于，还包括：S4、将V形微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况，并得到被检血清的血清效价。3.如权利要求2所述的禽流感血凝抑制试验检测方法，其特征在于，步骤S4中的凝集情况包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集时的被检血清的最大稀释度为该被检血清的HI滴度，即血清效价。4.如权利要求2所述的禽流感血凝抑制试验检测方法，其特征在于，步骤S2中的4单位禽流感病毒抗原液的制备方法具体为：a、另取V形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μL生理盐水；b、在第1孔加入50μL禽流感病毒液，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，第11孔弃去50μL；c、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μL体积分数为1％的鸡红细胞悬液；d、将微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，在第1孔至第12孔中出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底的性状时，以出现该性状的所有孔所对应的禽流感病毒液的最大稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即一个凝集单位，从而计算出4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度，根据4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度配制4单位禽流感病毒抗原液。5.如权利要求4所述的禽流感血凝...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晟，
申请(专利权)人：广西凤翔集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45