用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测突变的人AKT1基因的荧光PCR引物、试剂盒和方法。本发明专利技术采用依赖深海火球菌RNase H2酶的荧光PCR方法，同时对引物进行非常规设计以提高PCR反应的特异性，从而使得采用本申请的荧光PCR引物及方法可以精确地扩增出含有特定突变的AKT1基因序列，从而判断样品中AKT1的基因型，为肿瘤的诊断和治疗提供强有力的支持。

Primers, kit and method for detecting mutant human AKT1 gene

The invention discloses a fluorescent PCR primer, a kit and a method for detecting mutant human AKT1 gene. The present invention adopts the fluorescence PCR method which relies on the RNase H2 enzyme of the deep-sea fireball bacteria, and unconventional design of the primers to improve the specificity of the PCR reaction, so that the fluorescent PCR primers and methods of this application can be used to accurately amplify the sequence of AKT1 gene containing specific mutations, so that the genotype of AKT1 in the sample is judged. The diagnosis and treatment of tumors provide strong support.

【技术实现步骤摘要】
用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其是用于检测突变的人AKT1基因的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
随着肿瘤研究的发展，科学发现肿瘤是一种基因突变引起的慢性疾病。肿瘤的产生、发展、转移、治疗和检测，都与基因，特别是一些被称为驱动基因的突变有关。因此，肿瘤的基因检测已经成为肿瘤临床诊治中不可缺少的一环。AKT1基因位于人染色体14q32.32，基因全长26396bp，编码产物是AKT丝氨酸/苏氨酸激酶，长度为460个氨基酸。P53激酶/AKT途径是人类细胞信号中最为活跃的途径，AKT激酶是该途径的活性中心。在多种肿瘤，包括肺癌，乳腺癌，膀胱癌中都发现AKT1的基因突变rs121434592(即C49的鸟嘌呤变成了腺嘌呤，缩写为49G>A(p.Glu17Lys))导致癌细胞的过度生长，降低对药物的敏感性。因此，AKT1rs121434592基因是肿瘤诊治过程中最常见的检测突变之一。由于在肿瘤检测中，基因鉴定的方法主要是新一代基因测序法和荧光PCR方法。新一带基因测序方法能全面检测基因，甚至能发现未知的突变，但价格偏高。而荧光PCR只能检测已知的突变，但是其价格便宜。现有肿瘤检测的长期实践中，由于某些基因只是一个核苷酸突变，这种突变型和野生型的差异比较小，肿瘤基因鉴定的特异性不足是主要问题。即使科学的设计了针对某种基因的野生型和突变型的探针和引物并进行了优化，但是还可能出现低程度的交叉反应，给判断增加难度。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可准确地检测突变的AKT1基因的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：在一个方面，本专利技术提供了用于检测突变的人AKT1基因的荧光PCR引物，所述引物碱基序列如下：野生型AKT1引物F1：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATddW-3’(SEQIDNO.1)；突变型AKT1引物F2：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATddW-3’(SEQIDNO.2)；通用AKT1引物R1：5’-GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC-3’(SEQIDNO.3)；其中，g代表鸟嘌呤核糖核苷酸，G代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，a代表腺嘌呤核糖核苷酸，A代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，ddW代表双脱氧核糖核苷酸，W可以是A、T、C或G。应当说明的是，野生型和突变型AKT1引物F1的3’端第1个核苷酸是双脱氧核糖核苷酸，双脱氧核糖核苷酸无游离的3’羟基，不能进一步被DNA聚合酶延伸。因此，该设计能有效防止引物二聚体等非特异产物的生成，有效的降低了非特异信号。在野生型和突变型AKT1引物F1的3’端第9个核苷酸是核糖核苷酸，而不是脱氧核糖核苷酸。单独的引物并不会被深海热球菌的RNaseH2识别并结合；当引物与模板在退火温度结合并正确配对后，引物-模板复合物中的3端第9个核糖核苷酸才被深海热球菌RNaseH2识别，切割，形成了正常的引物-模板复合物，PCR的延伸反应才会起始。这两个设计有效的降低了非特异扩增，通常认为反应的特异性提高了30-100倍。在另一个方面，本专利技术提供了用于检测突变的人AKT1基因的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和深海火球菌的RNaseH2酶。深海火球菌(Pyrococcusabyssi)是一种嗜热的古菌，分离自北斐济2000米深的海底火山喷口。深海热球菌属于火球菌纲热球菌属，是一种厌氧的革兰氏阴性球菌，代谢硫化物为主要能源。RNaseH2是一种核糖核酸内切酶。如果一条DNA双链中某些位置是RNA，RNaseH2能识别该结构，并且从RNA分子的5’端切开，留下3’羟基游离的DNA分子和5’端磷酸基游离的RNA。在DNA聚合酶的作用下，3’羟基游离的DNA继续延伸，将后面’5端为游离RNA的核苷酸片段取代，形成完全的DNA双链。深海热球菌的RNaseH2与普通RNaseH2酶相比，能够在高温下(96℃)保持活性。基于深海热球菌的RNaseH2性质，将其应用于PCR体系中，能改善PCR体系的特异性。优选地，所述试剂盒还包括用于内控的引物，所述引物用于特异性扩增真核生物的18srDNA，所述引物序列如下：18srDNA引物F3:5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAATACaGGACddW-3’(SEQIDNO.4)；18srDNA引物R2:5’-ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC-3’(SEQIDNO.5)；由此，引物F3和R2用于监测PCR反应体系的有效性。优选地，所述试剂盒还包括对照品，所述对照品包括插入了如SEQIDNO.6所示的序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-W)和插入了如SEQIDNO.7所示序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-M)。在另一个方面，用于检测突变的人AKT1基因的方法，包括以下步骤：1)从样品中提取DNA；2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1的引物分别进行荧光PCR扩增反应获得扩增曲线；3)对扩增曲线分析，确定样品中AKT1基因的基因型。优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应体系为：其中，第一对引物为F1(SEQIDNO.1)和R1(SEQIDNO.3)，第二对引物为F2(SEQIDNO.2)和R1(SEQIDNO.3)。应当说明的是，p.a.是Pyrococcusabyssi(深海火球菌)的缩写，该细菌是从深海温泉中分离的一种古细菌，因此它的RNaseH2是一种热稳定的酶，能够在高温中将双链DNA中的RNA分子切除。p.a.RNaseH2能够在配对的双链核酸中包括DNA-RNA，RNA-RNA，切除RNA分子；而且p.a.RNaseH2酶的热稳定高，在95℃高温能保持稳定，适合应用于本申请的荧光PCR体系；进而，在PCR扩增时，只有当引物正确结合上模板，并且被p.a.RNaseH2切割下RNA及其后面的多个脱氧核苷酸后，引物才能延伸，有效防止引物二聚体的形成和其他非特异扩增的形成。优选地，所述步骤2)中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃延伸30s；循环50次。优选地，所述步骤2)中荧光PCR还包括作为对照的6组PCR体系，其根据模板和引物对的不同分为：a组：模板PUC57-AKT1-W、引物F1、引物R1；b组：模板PUC57-AKT1-W、引物F2、引物R1；c组：模板PUC57-AKT1-W、引物F3、引物R2；d组：模板PUC57-AKT1-M、引物F1、引物R1；e组：模板PUC57-AKT1-M、引物F2、引物R1；f组：模板PUC57-AKT1-M、引物F3、引物R2。应当说明的是，6组PCR体系与样品DNA的PCR体系区别仅在于模板和引物，其他试剂相同。优选地，所述步骤2)中扩增曲线的具体分析过程为：当作为内控信号的c组或f组的荧光PCR扩增曲线形成正常对数扩增“S”型曲线时，1)如果一个样品在采用引物对F1和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线，则该样本含有野生型AKT1；2)如果一个样品在采用引物对F2和R1的荧光PCR反应体系内，获得的荧光检本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测突变的人AKT1基因的荧光PCR的引物，其特征在于，所述引物碱基序列如下：野生型AKT1引物F1：5’‑CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATddW‑3’(SEQ ID NO.1)；突变型AKT1引物F2：5’‑CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATddW‑3’(SEQ ID NO.2)；通用AKT1引物R1：5’‑GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC‑3’(SEQ ID NO.3)；其中，g代表鸟嘌呤核糖核苷酸，G代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，a代表腺嘌呤核糖核苷酸，A代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，ddW代表双脱氧核糖核苷酸。

【技术特征摘要】
1.用于检测突变的人AKT1基因的荧光PCR的引物，其特征在于，所述引物碱基序列如下：野生型AKT1引物F1：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGgAGTACATddW-3’(SEQIDNO.1)；突变型AKT1引物F2：5’-CCCGCACGTCTGTAGGGaAGTACATddW-3’(SEQIDNO.2)；通用AKT1引物R1：5’-GGAGCCTCACGTTGGTCCACATC-3’(SEQIDNO.3)；其中，g代表鸟嘌呤核糖核苷酸，G代表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，a代表腺嘌呤核糖核苷酸，A代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，ddW代表双脱氧核糖核苷酸。2.用于检测突变的人AKT1基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物以及深海火球菌RNaseH2酶。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于内控的引物，所述引物用于特异性扩增真核生物的18srDNA，所述引物序列如下：18srDNA引物F3:5’-GGTAGTGACGAAAAATAACAATACaGGACddW-3’(SEQIDNO.4)；18srDNA引物R2:5’-ATACGCTATTGGAGCTGGAATTACC-3’(SEQIDNO.5)。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对照品，所述对照品包括插入了如SEQIDNO.6所示的序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-W)和插入了如SEQIDNO.7所示序列的PUC57质粒(PUC57-AKT1-M)。5.用于检测突变的人AKT1基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从样品中提取DNA；2)以提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴劲松，
申请(专利权)人：星阵广州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44