一种密叶杨遗传多样性的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种密叶杨遗传多样性的研究方法。包括：挑选雌株密叶杨和雄株密叶杨作为研究对象；提取雌株和雄株的DNA；检测DNA质量，选取条带清晰的DNA；筛选多态性好且条带清晰的引物；采用TP‑M13‑SSR PCR技术进行PCR扩增；对扩增产物进行毛细管电泳和自动荧光检测，记录原始数据；根据原始数据获得密叶杨雌株和密叶杨雄株群体的等位基因总数、等位基因位点数、有效等位基因数、期望杂合度、观察杂合度、Nei's遗传多样性指数和Shannon's多态性指数、基因分化系数及基因流参数；根据各参数评价密叶杨的遗传多样性。本发明专利技术方法对密叶杨遗传多样性进行了准确的科学研究分析，可为密叶杨选育提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种密叶杨遗传多样性的研究方法
本专利技术涉及林业
，尤其涉及一种密叶杨遗传多样性的研究方法。
技术介绍
密叶杨，乔木。树皮灰绿色，树冠开展；萌条微有棱角，棕褐色或灰色，初有毛，后几无毛，小枝灰色，近圆筒形，无毛，带叶短枝棕褐色，叶痕间常有短绒毛。萌枝叶披针形至阔披针形，长5-10cm，宽1.5-3cm，基部楔形或圆形，短枝叶卵圆形或卵圆状椭圆形，长5-8cm，宽3-5cm，先端渐尖，基部楔形，阔楔形或圆形，边缘浅圆齿，上面淡绿，无毛，下面较淡，常沿脉有疏毛；叶柄圆，长2-4cm，近无毛。雄花序长3-4cm，花序轴无毛，花药紫色。果序长5-6cm，果期长至10cm，果序轴有疏毛，下部较密；蒴果卵圆形，长5-8mm，3瓣裂，裂片卵圆形，无毛，多皱纹，具短柄，被绒毛。花期5月，果期6月。密叶杨主要生长地理环境，在山地河谷和前山地带的河谷两岸、草甸、村边、河谷、河谷林下、河滩、荒地、林中、路边、平原、平原密林中、渠边、沙地、山谷、山谷水边、山坡、溪边、阳坡、云杉林中，海拔500-1800m。在平原地区易受病虫害。喜光，抗寒，生长快。用种子和插条繁殖。地处新疆伊犁地区喀什河河谷流域地带天然次生林密叶杨是生态系统的最重要建群种，该天然次生林生态系统东西绵延110多公里，面积约21万亩，是西北地区面积最大、保护最完好的天然次生林，在区域防洪、涵养水源、防风固沙、避免水土流失、保持生物多样性、气候调节、景观文化旅游等方面发挥着重要作用。密叶杨在该生态系统中具有重要的支撑地位，其种群的遗传结构、遗传多样性状况对其可持续性发展有重要影响，也是影响该天然次生林生态系统稳定与发展的重要因素。多年来，由于河谷林两岸居民对次生林的盗伐、放牧、旅游资源项目开发等干扰活动及伴随着气候变暖，使得河床水位不断下降、土质退化等生境恶化，导致次生密叶杨林分布区逐步缩小和呈片段化趋势，河谷林开始发生衰退。密叶杨树种内性状变异极其复杂，丰富的基因资源是创新品种的遗传基础，研究雌雄株系的遗传多样性具有重要的选育种价值。因此，加强喀什河河谷密叶杨天然居群遗传多样性的研究，揭示其遗传结构，可为河谷林杨树基因资源的保存及退化居群的恢复提供基础理论依据。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种密叶杨遗传多样性的研究方法，主要目的研究分析密叶杨的遗传多样性和遗传分化性，为其选育提供基础。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种密叶杨遗传多样性的研究方法，所述方法包括以下步骤：(1)挑选雌株密叶杨和雄株密叶杨作为研究对象；(2)提取雌株和雄株的DNA；(3)检测DNA质量，选取条带清晰的DNA；(4)筛选多态性好且条带清晰的引物；(5)采用TP-M13-SSRPCR技术进行PCR扩增，得到扩增产物；(5)对所述扩增产物进行毛细管电泳和自动荧光检测，记录原始数据；(6)根据所述原始数据获得密叶杨雌株和密叶杨雄株群体的等位基因总数、等位基因位点数、有效等位基因数、期望杂合度、观察杂合度、Nei's遗传多样性指数和Shannon's多态性指数、基因分化系数及基因流参数；(7)根据各参数评价所述密叶杨的遗传多样性。作为优选，所述密叶杨的幼嫩枝条经过水培后，选取萌发的幼嫩叶片作为DNA提取对象。作为优选，所述DNA的提取过程：(1)取适量密叶杨叶片，放入遇冷的研钵中，加上PVPP，液氮，迅速研磨成细粉状，然后放入2ml的离心管中；(2)加入700ul65℃中预热的缓冲液GP1，漩涡震荡混匀后，放入65℃水浴锅中水浴20min，在此过程中，每隔一段时间颠倒离心管数次，以混匀样品；(3)加入700ul的氯仿，漩涡震荡后，12000r离心5min后，小心将上清液转移到一个新的2ml的离心管中，加入缓冲液GP2，充分混匀后，将混合的液体转移到吸附柱CB3中，12000r离心30s,弃掉废液，剩余的液体再次加入到吸附柱中离心，弃掉废液；(4)向吸附柱内加入500ul的去蛋白液GD，12000r离心30s，弃掉废液；(5)向吸附柱内加入700ul的漂洗液PW，12000r离心30s，弃掉废液，重复步骤5的操作；.(6)将吸附柱放回空的收集管中，12000r离心2min，然后将吸附柱至于室温下晾干数分钟，使得吸附柱上的漂洗液彻底晾干；(7)将吸附柱放于干净的1.5ml离心管中，向吸附柱中悬空滴加150ul的洗脱缓冲液TE，室温放置数分钟后，12000r离心30s，将得到的液体重新吸回吸附柱中，室温放置2min，12000r离心2min；(8)将得到的密叶杨全基因组DNA样品放置于-20℃的冰箱内保存备用。作为优选，所述检测DNA质量的过程：将4ul所述密叶杨全基因组DNA样品和2ul的6×Loadingbuffer缓冲液混合后加入到含有GoldenView琼脂糖凝胶中，在电压150v下电泳20～30min，电泳完成后在紫外凝胶成像系统下观察并拍照；观测所得DNA条带是否清晰，有无降解，并根据DNAMarker估测DNA片段的大小；依据电泳结果，把DNA稀释到所需浓度，-20℃保存备用。作为优选，所述筛选引物的过程：根据已有毛果杨的SSR引物序列，通过基因库查找出分布在19对上的200多对引物，进行引物的筛选；在筛选过程中，随机抽取8个DNA样本，雌雄各4个，采用TP-M13-SSRPCR技术进行PCR扩增；最终得到的PCR产物在ABI-3730xl基因分析仪上进行，其步骤为：取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和甲酰胺8.5μL混合加入96孔板，95℃变性5min，1×Buffer缓冲液上机检测，经GeneMarkerV2.2.0软件进行分析，最终筛选出多态性好、条带清晰的引物。作为优选，所述TP-M13-SSR技术的扩增引物为：在PCR反应中选择3条引物，第一条为5'端连接M13序列的正向引物，第二条为正常的反向引物，第三条为标有荧光的M13引物，即TP-M13引物。作为优选，所述PCR反应反应程序：程序1：95℃5min；程序2：95℃30s；60℃30s，其中，每个循环降低1℃；72℃30s；其中，进行10个循环；程序3：95℃30s；50℃30s；72℃30s；其中，进行20个循环；程序4：72℃7min；程序5：4℃∞。作为优选，所述雌株的样本个数为68株，所述雄株的样本个数为142株；所述密叶杨雌株系的等位基因位点数为6.4583，观察杂合度为0.6024；所述密叶杨雄株系的等位基因位点数为5.6250，观察杂合度为0.5897。作为优选，所述多态性好、条带清晰的引物个数为24对，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.1-SEQIDNO.48。(本专利技术进行扩增主要是获取扩增产物的DNA片段大小)与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用TP-M13-SSRPCR技术对喀什河谷流域密叶杨遗传多样性的研究分析，准确确定了密叶杨的多态性情况，为密叶杨的选育提供一定理论基础，并且对保护基因资源，维持遗传多样性和可持续发展具有重要意义。附图说明图1是本专利技术实施例提供的密叶杨部分株系DNA凝胶电泳图；图2是本专利技术实施例提供的引物GCPM_3390-1扩增毛细管电泳图；图3是本专利技术实施例提供的引物GCPM_2613-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密叶杨遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)挑选雌株密叶杨和雄株密叶杨作为研究对象；(2)提取雌株和雄株的DNA；(3)检测DNA质量，选取条带清晰的DNA；(4)筛选多态性好且条带清晰的引物；(5)采用TP‑M13‑SSR PCR技术进行PCR扩增，得到扩增产物；(5)对所述扩增产物进行毛细管电泳和自动荧光检测，记录原始数据；(6)根据所述原始数据获得密叶杨雌株和密叶杨雄株群体的等位基因总数、等位基因位点数、有效等位基因数、期望杂合度、观察杂合度、Nei's遗传多样性指数和Shannon's多态性指数、基因分化系数及基因流参数；(7)根据各参数评价所述密叶杨的遗传多样性。

【技术特征摘要】
1.一种密叶杨遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)挑选雌株密叶杨和雄株密叶杨作为研究对象；(2)提取雌株和雄株的DNA；(3)检测DNA质量，选取条带清晰的DNA；(4)筛选多态性好且条带清晰的引物；(5)采用TP-M13-SSRPCR技术进行PCR扩增，得到扩增产物；(5)对所述扩增产物进行毛细管电泳和自动荧光检测，记录原始数据；(6)根据所述原始数据获得密叶杨雌株和密叶杨雄株群体的等位基因总数、等位基因位点数、有效等位基因数、期望杂合度、观察杂合度、Nei's遗传多样性指数和Shannon's多态性指数、基因分化系数及基因流参数；(7)根据各参数评价所述密叶杨的遗传多样性。2.如权利要求1所述的一种密叶杨遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述密叶杨的幼嫩枝条经过水培后，选取萌发的幼嫩叶片作为DNA提取对象。3.如权利要求2所述的一种密叶杨遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述DNA的提取过程：(1)取适量密叶杨叶片，放入遇冷的研钵中，加上PVPP，液氮，迅速研磨成细粉状，然后放入2ml的离心管中；(2)加入700ul65℃中预热的缓冲液GP1，漩涡震荡混匀后，放入65℃水浴锅中水浴20min，在此过程中，每隔一段时间颠倒离心管数次，以混匀样品；(3)加入700ul的氯仿，漩涡震荡后，12000r离心5min后，小心将上清液转移到一个新的2ml的离心管中，加入缓冲液GP2，充分混匀后，将混合的液体转移到吸附柱CB3中，12000r离心30s,弃掉废液，剩余的液体再次加入到吸附柱中离心，弃掉废液；(4)向吸附柱内加入500ul的去蛋白液GD，12000r离心30s，弃掉废液；(5)向吸附柱内加入700ul的漂洗液PW，12000r离心30s，弃掉废液，重复步骤5的操作；(6)将吸附柱放回空的收集管中，12000r离心2min，然后将吸附柱至于室温下晾干数分钟，使得吸附柱上的漂洗液彻底晾干；(7)将吸附柱放于干净的1.5ml离心管中，向吸附柱中悬空滴加150ul的洗脱缓冲液TE，室温放置数分钟后，12000r离心30s，将得到的液体重新吸回吸附柱中，室温放置2min，12000r离心2min；(8)将得到的密叶杨全基因组DNA样品放置于-20℃的冰箱内保存备用。4.如权利要求3所述的一种密叶杨遗传多样性的研究方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小虎，张萍，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65