一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测中成药“参苓白术散”中多个主药的引物、检测试剂以及试剂盒和方法。本发明专利技术采用一种改进的CTAB方法从中成药“参苓白术散”提取基因组DNA，对基因组DNA进行全基因组扩增，改善DNA的质量，设计特异性引物，并采用突变扩增系统‑荧光定量PCR方法实现同时检测“参苓白术散”的多种主药成分。本发明专利技术可以精确地对人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等六种成分的特异基因，从而准确地判断出参苓白术散样品中是否含这六种组分，为中成药的监测提供强有力的支持。

【技术实现步骤摘要】
一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及基因检测
，具体地说，涉及一种基于ARMS-荧光定量PCR法同时检测“参苓白术散”多种主药成分的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
药用植物可以作为药品、保健品，相关产业发达，但是药用植物的掺假现象极其严重。中药掺假不仅降低了药效，还容易产生毒副作用。由多种药用植物加工的复合型产品，如中成药，成分隐蔽，更难以鉴别。当前，多种科学方法用于药用植物的鉴定，包括宏观形态学分析、显微观察、多种色谱分析，基因鉴定。中成药“参苓白术散”是一种常见的散剂，根据《宋·太平惠民和剂局方》和《中国药典》的记载，其加工方法为：莲子肉(去皮)、薏苡仁、缩砂仁、桔梗(炒令深黄色)，各一斤。白扁豆(姜汁浸.去皮.微炒)一斤半，白茯苓、人参(去芦)、甘草(炒)、白术、山药，各二斤，粉碎成细粉，过筛，混匀，得到成品。由于“参苓白术散”经过深加工，形态学分析，显微观察等宏观方法无法进行，多种色谱分析的设备昂贵，时间漫长，无法成为一种方便的检测方法。因此，基因鉴定是一种方便性，可靠性俱佳的中药成分鉴定方法。既往研究发现，一组基因可以作为植物物种基因鉴定的一种标准，其编码的基因序列被称为DNA条形码。用做DNA条形码的基因的特点是：同一种植物，其编码序列完全相同，或者高度相似；而其他物种随着亲缘关系由近到远，其编码序列相似性逐步越低。对中成药的物种鉴定，本质上对多个物种基因组的混合物，进行基因分型。多个物种的ITS2基因差异，主要是各种点突变，包括单核苷酸突变，单核苷酸缺失，单核苷酸插入等。中成药的基因分型主要有四大类：第一类是目前常规的Sanger测序法，也称DNA条形码方法。主要实验步骤为：首先，对植物进行基因组DNA的提取；其次，用一套ITS2基因的通用引物，对基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行Sanger测序；最后，将测序结果与数据库中各个物种ITS2的基因序列进行比对分析，确定药用植物的物种。该方法是物种鉴定的标准，但是需要昂贵的仪器设备、周期长、工作繁琐。第二类是基于PCR的方法，如PCR-PFLP、PCR-芯片杂交法等。这一类方法的共同缺陷是在进行PCR以后，还需要进行酶切、电泳、杂交等操作，反应时间长，检测准确率低、通量低，这类方法都不适用于大量样本，也不适合常规操作。第三类是基于高通量测序方法。高通量测序法基本过程与Sanger测序方法相似，尤其是可以获得任意植物混合物中所有未知的物种的信息。但是高通量测序的缺点为成本太过高昂，时间周期过长，不适用于常规操作及推广。第四类基于荧光定量PCR方法，更广泛适用于各种常规基因鉴定。其中，TaqMan探针法，针对特定的物种设计PCR引物和TaqMan探针。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针的序列与待鉴定物种完全匹配，而与其他容易混淆的物种不完全匹配。当荧光定量PCR反应体系中存在特定物种的基因组时，该探针与模板形成互补双链，产生了适合于核酸外切酶活性的底物。当PCR扩增时，DNA聚合酶将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。这种方法精确，但主要缺点为探针合成的成本高，保存期短。突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是合成一对引物，其中一条或者两条引物的3’-端碱基，与特定模板的独有碱基完全互补，而与容易混淆的物种在3’-端有一个或者多个碱基的差异。引物3’-端的特异碱基分别与模板形成错配，链延伸反应就会因3′,5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻。当在溶液中加入荧光染料，比如SYBRGreenI，就可以定量的看到靶基因的扩增。这种检测方法无需序列特异性探针，成本低，结果准确。
技术实现思路
本专利技术提供了基于ITS2基因的单核苷酸变异的可用于定性“参苓白术散”的主药成分的特异引物序列，并采用ARMS-荧光定量PCR方法实现同时检测“参苓白术散”的多种主药成分。本专利技术的另一目的，是建立一种通用的多种植物混合物中的ARMS荧光PCR鉴定方法，可以推广到绝大多数中成药的基因鉴定方法，为中成药的基因鉴定建立一种模式。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于定性参苓白术散的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁的扩增引物、内控引物、PCR试剂。进一步地，上述人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁扩增引物序列如下：人参扩增引物序列：Rensen-F：5’-CGGGACAATAAATAACAATACCGGGCTGATTC-3’；Rensen-R：5’-GCCAGTTAAGGACAGGAGCGC-3’；茯苓引物序列如下：Fuling-F：5’-GAACGGGAACCCTAGAAATCGTTAAGG-3’；Fuling-R：5’-CTAATCTGTTTGTCCATCCGACCCG-3’；白术引物序列如下：Baizhu-F：5’-GTGACGCAACTATCGGGTCCT-3’；Baizhu-R：5’-CGGTGTTTGTTTACGTGCCGG-3’；山药引物序列如下：Shanyao-F：5’-AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-3’；Shanyao-R：5’-GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA-3’；莲子引物序列如下：lianzi-F：5’-AGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTC-3’；lianzi-R：5’-TCACACACTCGACACCCCAATGA-3’；薏苡仁引物序列如下：Yiyiren-F：5’-AAGACGAGGTGGGCCAAAGTT-3’；Yiyiren-R：5’-ACGTGATGTGCACGACACGA-3’。进一步地，上述内控引物为真核生物18srDNA扩增引物。更进一步地，上述真核生物18srDNA扩增引物序列如下：18srDNA-F：5’-GGAAGGATCATTGTCGAAACCTGC-3’；18srDNA-R：5’-GTGCCAGTATTTAGCCTTGGACGGAATTTACC-3’。一种用于定性检测参苓白术散的检测试剂盒，包括上述检测试剂和阳性对照。进一步地，上述阳性对照人参基因组DNA、茯苓基因组DNA、白术基因组DNA、山药基因组DNA、莲子基因组DNA、薏苡仁基因组DNA。参苓白术散定性检测盒在参苓白术散定性检测中的应用，其中，参苓白术散定性检测试剂使用方法如下所示：1)从“参苓白术散”样品中提取DNA；2)使用如权利要求5～6所述试剂盒对样品DNA进行PCR扩增；3)参照阳性对照，定性样品。进一步地，上述PCR扩增反应体系为：进一步地，上述PCR反应条件为：95℃预本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定性参苓白术散的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁的扩增引物、内控引物、PCR试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于定性参苓白术散的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁的扩增引物、内控引物、PCR试剂。


2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述人参、茯苓、白术、山药、莲子、薏苡仁扩增引物序列如下：
人参扩增引物序列：
Rensen-F：5’-CGGGACAATAAATAACAATACCGGGCTGATTC-3’；
Rensen-R：5’-GCCAGTTAAGGACAGGAGCGC-3’；
茯苓引物序列如下：
Fuling-F：5’-GAACGGGAACCCTAGAAATCGTTAAGG-3’；
Fuling-R：5’-CTAATCTGTTTGTCCATCCGACCCG-3’；
白术引物序列如下：
Baizhu-F：5’-GTGACGCAACTATCGGGTCCT-3’；
Baizhu-R：5’-CGGTGTTTGTTTACGTGCCGG-3’；
山药引物序列如下：
Shanyao-F：5’-AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-3’；
Shanyao-R：5’-GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA-3’；
莲子引物序列如下：
lianzi-F：5’-AGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTC-3’；
lianzi-R：5’-TCACACACTCGACACCCCAATGA-3’；
薏苡仁引物序列如下：
Yiyiren-F：5’-AAGACGAGGTGGGCCAAAGTT-3’；
Yiyiren-R：5’-ACGTGATGTGCACGACACGA-3’。


3.根据权利要求1所述的检测试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴劲松，
申请(专利权)人：星阵广州基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44