高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7及其在制备D-泛解酸内酯中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种经土壤筛选和低温等离子体诱变所获得的高产D‑泛解酸内酯酶的黑霉菌BFA010‑7，保藏编号为CGMCC 14631，以及上述黑曲霉菌株BFA010‑7在制备D‑泛解酸内酯中的应用。本发明专利技术中，黑曲霉菌丝体通过包埋方式在海绵块中生长繁殖，然后通过化学交联法制备获得固定化细胞催化剂，整个工艺简便易行、廉价实用、易于放大。制备所得的固定化细胞催化剂具有活性高、操作稳定性好以及易于分离回收等优点，在D‑泛酸钙工业生产过程中具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7及其在制备D-泛解酸内酯中的应用
本专利技术属于生物工程
，更具体的涉及一种D-泛解酸内酯酶高产菌株的土壤筛选和诱变育种，诱变菌株的发酵培养和细胞固定化，以及固定化细胞在生物水解制备光学活性D-泛解酸内酯中的应用。
技术介绍
D-泛解酸内酯是合成D-泛醇、D-泛酸和D-泛酸钙的重要手性中间体。采用D-泛解酸内酯酶优先催化外消旋底物中D-泛解酸内酯的水解，收集水解所得的D-泛解酸，经酸化和加热即可转变成高光学纯度的D-泛解酸内酯。具有高活性、高选择性与高稳定性的D-内酯水解酶催化剂，是高效、低成本地生产D-泛解酸内酯及其衍生产品的核心技术要素。在现有的科技论文和专利文献中，公开了大量表达D-泛解酸内酯酶的微生物菌株(例如CN100351369C,CN102229894B)，其中高产D-泛解酸内酯酶的微生物菌株分别属于镰孢霉菌、赤霉菌、泡盛曲霉以及番茄织球壳菌，这些微生物大部分都是植物致病菌，用这些菌株进行D-泛解酸内酯酶的发酵生产及催化反应不利于环境保护和人身安全。黑曲霉是国际公认的安全无害的微生物，已经广泛应用于生物饲料添加剂的生产，并可作为有益微生物直接用于饲料中。专利CN100351369C中，虽然提及一些黑曲霉也能催化泛解酸内酯的水解，在相应的显色平板上产生显色圈，但是由于没有对黑曲霉进行进一步诱变育种，该专利中所公开的那些黑曲霉菌株的产酶活力并不高。如果对土壤分离的黑曲霉菌株进行大规模诱变和筛选，有可能获得生物安全而且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株。迄今已报道的高产D-泛解酸内酯酶的微生物菌株大多是产菌丝体的真菌。反应器中菌丝体的生长对搅拌产生的剪切力比较敏感，如果搅拌转速过高，不仅会造成菌丝体断裂，严重影响菌丝体的过滤分离过程，而且酶的产量也会受到严重影响(江南大学硕士学位论文，微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯，2001年)。由于菌丝体细胞本身很容易通过过滤等方式进行分离，在发酵液中直接加入戊二醛，对菌丝体细胞以及胞内的酶进行交联固定化是一种快速高效的固定化方法，制备所得的固定化细胞具有稳定性高、易于分离的优点(EnzymeandMicrobialTechnology,2004,35:161–166)。尽管如此，固定化菌丝体细胞在应用时，反应液粘度高、传质差，并且在长时间使用后，由于菌丝体的断裂，会导致固定化细胞的分离回收困难。专利CN101343627A公开了串珠镰孢霉菌固体发酵生产D-泛解酸内酯酶的方法，解决了液体发酵过程中搅拌剪切力对菌丝体的影响，但该专利未公开菌丝体细胞的固定化方法。江苏省农科院报道了采用海绵对香菇菌丝体进行固定化培养的方法(食用菌，2001(1)：8-9)，如果将这种方法应用于D-泛解酸内酯酶的发酵生产中，菌丝体生长在海绵块的内部，可以有效地避免搅拌剪切力对菌丝体生长的影响，降低发酵液和反应液的粘度，有利于强化传质并且简化细胞的分离。
技术实现思路
1、专利技术目的。本专利技术提供了一种生物安全且高产D-泛解酸内酯酶的黑曲霉菌株；进一步通过海绵固定化培养的方式，避免菌丝体与搅拌桨的直接接触，消除剪切力对丝状微生物生长的不利影响。2、本专利技术所采用的技术方案。本专利技术采用的技术方案之一：泛解酸内酯酶产生菌种的筛选土壤样本的采集：在上海、江苏、浙江、山东、广西等省市的不同地点和环境中采集土样，在以泛解酸内酯为唯一碳源的富集培养基中进行富集，然后取适量菌液涂布于含有碳酸钙和泛解酸内酯的PDA固体培养基平板上进行培养，分离呈现明显透明圈的黑曲霉菌株。将分离获得的黑曲霉菌株分别接种到液体丰富培养基中进行培养，比较D-泛解酸内酯酶的发酵活力以及立体选择性，获得高活性和高选择性D-泛解酸内酯酶的产生菌株，命名为黑曲霉BFA010。对筛选的菌株进行了ITS序列的分子鉴定，结合微生物生长形态特征，确实属于黑曲霉。所述D-泛解酸内酯酶发酵活力的测定方法为：将分离筛选所得的黑曲霉菌株分别接种到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、200rpm振摇培养2天，取2ml菌液转接到装有25ml液体丰富培养基的250ml三角烧瓶中，30℃、200rpm继续振摇培养2天，取10ml菌液，抽滤除去培养基，将滤饼加到10ml含2％(w/v)泛解酸内酯的磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.5)中，30℃，磁力搅拌反应，通过全自动滴定仪滴加0.1MNaOH溶液，控制反应液的pH恒定于6.5附近，持续反应10min，根据滴加的碱液体积计算发酵液中的D-泛解酸内酯酶的活力。D-泛解酸内酯酶的活力单位(U)定义为：上述反应条件下，每分钟催化1.0μmol泛解酸内酯水解所需要的酶量。D-泛解酸内酯酶的发酵活力计算公式为，发酵活力(U/L)＝VNaOH×1000，其中VNaOH是反应10min时滴加碱液的体积(ml)。所述D-泛解酸内酯酶的立体选择性检测方法为：取0.5ml上述发酵活力测定反应液，加入等体积乙酸乙酯进行萃取，离心分离，弃去有机相萃取液，再次加入等体积乙酸乙酯进行萃取，如此重复4次。向萃取残余水相中加入0.2ml的硫酸溶液(20％,w/v)，80℃保温30min，使酶促水解产物D-泛解酸内酯化生成D-泛解酸内酯，反应液冷却后再次加入0.5ml乙酸乙酯进行萃取。萃取液中加入无水硫酸镁干燥，然后通过气相色谱分析D-泛解酸内酯的光学纯度。本专利技术采用的技术方案之二：黑曲霉BFA010的等离子体诱变育种将土壤分离筛选所获得的黑曲霉菌株BFA010接种于斜面固体培养基上，待孢子长好后，向斜面试管中加入无菌水，使用接种环将斜面孢子刮到无菌水中。将孢子悬浮液适当稀释后置于等离子体发生仪箱体中，进行等离子诱变处理。选择高纯氦气作为等离子体的工作气体，照射的功率为40W，照射距离为4mm，等离子体的温度<30℃，气体流量10L/min，处理菌液10μL，处理时间为40s。将诱变处理的孢子悬浮液涂布到含有D-泛解酸内酯和碳酸钙的固体丰富培养基平板上进行培养，挑选具有显著透明圈的菌落，接种到液体丰富培养基中培养，对D-泛解酸内酯酶的发酵产量进行比较，选择发酵活力较高，而对映选择性没有下降的8株突变株作为下一轮诱变的出发菌株，如此多轮反复诱变，筛选获得D-泛解酸内酯酶产量显著提高的突变黑曲霉菌株BFA010-7，其D-泛解酸内酯酶的发酵产量是母本菌株的11.7倍。黑曲霉突变菌株BFA010-7已专利保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNO.14631，保藏时间为2017年11月03日。所述黑曲霉突变菌株BFA010-7(即黑曲霉CGMCC14631)具有如下形态特征：在PDA培养基上，菌落生长较快，30℃培养3天，菌落直径超过25mm，菌落外缘整齐，表面呈黑色，细粉状，菌落中心菌丝致密突起，菌落底部中心呈白色，四周为淡黄色。对该菌株的ITS1和ITS4序列进行测序，测得的ITS1和ITS4核酸序列分别如序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。本专利技术采用的技术方案之三：黑曲霉菌株BFA010-7的固定化培养与菌丝体化学交联将黑曲霉菌株BFA010-7接种到固体斜面培养基表面，30℃培养2天，用无菌水将黑曲霉孢子洗下，接种到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010‑7，其特征在于：该菌株已于2017年11月03日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 14631。

【技术特征摘要】
1.一种高产左旋内酯水解酶的黑曲霉菌株BFA010-7，其特征在于：该菌株已于2017年11月03日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC14631。2.根据权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7，其特征在于：该菌株的ITS1和ITS4序列的核酸序列分别如序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。3.权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7在制备D-泛解酸内酯中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其步骤包括：(1)细胞固定化培养：将权利要求1所述的黑曲霉菌株BFA010-7接种到含有海绵块的无菌培养液中进行培养；(2)细胞化学交联：在步骤(1)的培养液中加入戊二醛进行丝状真菌细胞共价自交联，然后分离获得海绵包埋的固定化细胞；(3)将步骤(2)的固定化细胞添加到外消旋泛解酸内酯的水溶液中，催化D-泛解酸内酯的水解反应，获得D-泛解酸；(4)分离上述步骤(3)的反应液中的固定化细胞，固定化细胞可重复利用，使用有机溶剂萃取分离除去步骤(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘江，许建和，郑高伟，张志钧，钱小龙，赵朋，戴忆思，
申请(专利权)人：苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32