一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，包括三种源多糖的分子量测定、多糖含量测定、结构鉴定和抗缺氧功能特性判定，以获取柴达木大肥菇抗缺氧多糖分子量、多糖含量、多糖结构特征和抗缺氧功能特性等多项参数，从而为柴达木大肥菇抗缺氧多糖的实际应用提供数据支撑，发挥其功效，对人类的健康发展提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定检测方法。
技术介绍
柴达木大肥菇Agaricusbitorquis(QuéL.)Sacc.又名双层环伞菌，分类上属双孢菇变种，是青藏高原柴达木盆地特殊生态环境条件下的一种分类十分重要的野生大型食用真菌。因其生长在恶劣的环境下使其具有子实体巨大、抗逆性强、地下结实、低温出菇等特点，为大肥蘑菇中的特殊菌种。柴达木大肥菇子实体含粗蛋白24.0％、粗脂肪2.10％、粗纤维17.32％、碳水化合物34.91％、灰分13.65％。由于柴达木大肥菇是生长于青藏高原柴达木盆地的一种特殊菌种，所以国外对其研究几乎没有，而在国内虽然对其有不少研究报道，但其中关于三种不同来源纯化多糖用DEAE-52纤维素层析法分离纯化多糖，用DEAE-52层析柱测定多糖分子量，用改良苯酚-硫酸法测定多糖含量，用液体超导核磁共振谱仪测定多糖结构，检验多糖抗缺氧功能(依据《保健食品功能学评价程序和检测方法》评价)研究却没有。虽然近年来多糖类物质的研究取得了很大的进展，开展了抗肿瘤、耐疲劳、降血糖等功能活性研究，但是无论是从国内还是国外来看，对食用菌多糖尤其是柴达木大肥菇多糖抗缺氧活性的研究还未见到。目前柴达木大肥菇多糖的研究还存在许多尚未解决的问题，比如，多糖抗缺氧的构效关系问题等。由于柴达木大肥菇抗缺氧多糖的多项参数都没有获得有效的数据，从而使柴达木大肥菇抗缺氧多糖的功能应用受到了制约。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，通过该鉴定方法可以获得柴达木大肥菇抗缺氧多糖分子量、多糖含量、多糖结构和和多糖抗缺氧功能特性等参数。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：一、柴达木大肥菇多糖分子量范围测定多糖分子量的测定流程：根据标准葡聚糖绘制分子量标准曲线→样品分子量的测定→分子量的确定；先测定出葡聚糖标准品在DEAE-52凝胶柱中的保留时间，以已知分子量标准品的保留时间tR为横坐标,以相应分子量的对数值为纵坐标lgMN，绘制出标准品分子量的标准曲线；1)将葡聚糖系列标准品3000、4320、50000、12600和110000Da分别用0.2NNaCl水溶液配成质量浓度为2mg/mL的溶液，按混合组分分离，加样1mL，按1管/min收集，测定保留时间；2)以IgMN分子质量对数对tR保留时间绘制标准曲线，得到线性回归方程，然后将浓度为2mg/mL的柴达木大肥菇子实体多糖与菌丝体多糖混合液加样，测定其保留时间，按保留时间计算出柴达木大肥菇子实体与菌丝体多糖的分子量；二、多糖含量测定1)制定标准曲线：精确配制0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后分别配成0,0.005,0.01,0.015,0.02,0.025,0.03,0.035,0.04,0.045,0.05mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液，加入0.5mL6％苯酚溶液，5mL浓硫酸在沸水浴中加热15min后，取出立即放入流动水中冷却，用紫外分光光度计测定各样液的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出标准曲线；2)测定待测样品多糖含量：提取的大肥菇粗多糖，取多糖于150mL容量瓶中定容，取1mL溶液，加入1mL蒸馏水、1mL6％苯酚溶液、5mL浓硫酸，至沸水浴中加热15min后，取出放入流动水中迅速冷却，用紫外分光光度计测定各样液在490nm处测定吸光值，通过标准曲线方程计算多糖含量，计算公式M＝(A-b)/K；其中M为多糖质量，单位为mg；A为反应后的样液在490nm处的吸光度值；b为标准曲线的纵截距；K为标准曲线的斜率；三、多糖结构测定1)取多糖冻干粉样品在离心管中用重水溶解第1次，然后冻干，用重水溶解第2次，再冻干，用重水溶解第3次，以去除样品中的普通水，全部替换为重水；2)得到的最终溶解体积为0.6mL、浓度为60-120mg/mL的液体移入核磁管，加入一滴丙酮作为内标(10-20μL)，然后H谱检测2h，C谱检测12h。优选地，在多糖结构测定过程的步骤2)中，得到的最终溶解液体的浓度为70-80mg/mL。优选地，在多糖含量测定过程的步骤1)中，用紫外分光光度计测定各样液在490nm处吸光度值，每组浓度做三次平行试验，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出标准曲线。进一步地，在多糖分子量测定步骤中，分别将柴达木大肥菇子实体、菌丝体、发酵液多糖分离纯化后的各个组分配成浓度为2mg/mL的样液，进行DEAE-52凝胶层析，1mL进行加样，1管/min收集，绘制洗脱曲线。对柴达木大肥菇多糖的分离纯化可以通过以下工艺实现：DEAE-52纤维素柱层析流程：DEAE-52纤维素预处理→装柱→平衡过夜→上样→Nacl溶液梯度洗脱→收集多糖→苯酚硫酸法测多糖→浓缩、透析；1)DEAE-52预处理：首先将DEAE-52纤维素浸泡于蒸馏水中24h，其间换几次水，每次除去细小颗粒；后于0.5NHCL溶液中浸泡1-2h，并不断搅拌，蒸馏水或去离子水洗涤至中性，抽干；再将DEAE-52浸泡于0.5NNaOH溶液1-2h，同上操作，重复三次，低温保藏，备用；2)装柱：首先向层析柱中注入蒸馏水，打开下出液口，使水流均匀，即刻将纤维素轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，直到层析柱上端3～5cm处，停止装柱，使其自然沉降，平衡静置24h；3)上样:将脱色、脱蛋白粗多糖浓缩液，上样浓度为15-25mg/mL，上样体积，即树脂层析柱体积为0.02-0.03BV；梯度洗脱：采用0-3.0moL/LNaCl溶液依次洗脱，恒流泵流速：1mL/min，1min/管自动部份收集，苯酚-硫酸法检测出无糖，即洗脱完毕；4)DEAE-52的再生：用过的树脂经过再生处理以反复使用，先用2moL/L的NaCL溶液冲洗至流出液无色，再分别用0.5N的HCL和NaOH溶液浸泡处理，最后用去离子水洗至中性；5)DEAE-52的活化：将再生后的DEAE-52树脂放在蒸馏水中浸泡12h，再用0.5NHCL溶液浸泡2h，用蒸馏水或去离子水洗至中性，抽干，浸泡于0.5NNaOH溶液2h，用蒸馏水或去离子水洗至中性即可；6)检测：用考马斯亮蓝试剂检测蛋白质含量，用苯酚-硫酸法检测糖含量。本专利技术对利用DEAE-52纤维素柱层析方法得到纯度较高的多糖成品进行鉴定，以获取柴达木大肥菇抗缺氧多糖分子量、多糖含量和多糖分子量等多项参数，从而为柴达木大肥菇抗缺氧多糖的实际应用提供数据支撑，发挥其功效，对人类的健康发展提供帮助。附图说明图1为葡萄糖溶液标准曲线；图2为葡聚糖分子量标准曲线；图3为子实体多糖的DEAE-52洗脱曲线；图4为菌丝体多糖的DEAE-52洗脱曲线；图5为发酵液多糖的DEAE-52洗脱曲线；图6为子实体多糖组分A氢谱；图7为子实体多糖组分A氮谱；图8为菌丝体多糖组分A氢谱；图9为菌丝体多糖组分A氮谱；图10为发酵液多糖组分A氢谱；图11为发酵液多糖组分A氮谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但这并不意味着对本专利技术的任何限制。所述柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，按以下步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：一、柴达木大肥菇多糖分子量范围测定多糖分子量的测定流程：根据标准葡聚糖绘制分子量标准曲线→样品分子量的测定→分子量的确定；先测定出葡聚糖标准品在DEAE‑52凝胶柱中的保留时间，以已知分子量标准品的保留时间tR为横坐标,以相应分子量的对数值为纵坐标lgMN，绘制出标准品分子量的标准曲线；1)将葡聚糖系列标准品3000、4320、50000、12600和110000Da分别用0.2N NaCl水溶液配成质量浓度为2mg/mL的溶液，按混合组分分离，加样1mL，按1管/min收集，测定保留时间；2)以IgMN分子质量对数对tR保留时间绘制标准曲线，得到线性回归方程，然后将浓度为2mg/mL的柴达木大肥菇子实体多糖与菌丝体多糖混合液加样，测定其保留时间，按保留时间计算出柴达木大肥菇子实体与菌丝体多糖的分子量；二、多糖含量测定1)制定标准曲线：精确配制0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后分别配成0,0.005,0.01,0.015,0.02,0.025,0.03,0.035,0.04,0.045,0.05mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液，加入0.5mL6％苯酚溶液，5mL浓硫酸在沸水浴中加热15min后，取出立即放入流动水中冷却，用紫外分光光度计测定各样液的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出标准曲线；2)测定待测样品多糖含量：提取的大肥菇粗多糖，取多糖于150mL容量瓶中定容，取1mL溶液，加入1mL蒸馏水、1mL 6％苯酚溶液、5mL浓硫酸，至沸水浴中加热15min后，取出放入流动水中迅速冷却，用紫外分光光度计测定各样液在490nm处测定吸光值，通过标准曲线方程计算多糖含量，计算公式M＝(A‑b)/K；其中M为多糖质量，单位为mg；A为反应后的样液在490nm处的吸光度值；b为标准曲线的纵截距；K为标准曲线的斜率；三、多糖结构测定1)取多糖冻干粉样品在离心管中用重水溶解第1次，然后冻干，用重水溶解第2次，再冻干，用重水溶解第3次，以去除样品中的普通水，全部替换为重水；2)得到的最终溶解体积为0.6mL、浓度为60‑120mg/mL的液体移入核磁管，加入一滴丙酮作为内标，然后H谱检测2h，C谱检测12h。...

【技术特征摘要】
1.一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：一、柴达木大肥菇多糖分子量范围测定多糖分子量的测定流程：根据标准葡聚糖绘制分子量标准曲线→样品分子量的测定→分子量的确定；先测定出葡聚糖标准品在DEAE-52凝胶柱中的保留时间，以已知分子量标准品的保留时间tR为横坐标,以相应分子量的对数值为纵坐标lgMN，绘制出标准品分子量的标准曲线；1)将葡聚糖系列标准品3000、4320、50000、12600和110000Da分别用0.2NNaCl水溶液配成质量浓度为2mg/mL的溶液，按混合组分分离，加样1mL，按1管/min收集，测定保留时间；2)以IgMN分子质量对数对tR保留时间绘制标准曲线，得到线性回归方程，然后将浓度为2mg/mL的柴达木大肥菇子实体多糖与菌丝体多糖混合液加样，测定其保留时间，按保留时间计算出柴达木大肥菇子实体与菌丝体多糖的分子量；二、多糖含量测定1)制定标准曲线：精确配制0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后分别配成0,0.005,0.01,0.015,0.02,0.025,0.03,0.035,0.04,0.045,0.05mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖溶液，加入0.5mL6％苯酚溶液，5mL浓硫酸在沸水浴中加热15min后，取出立即放入流动水中冷却，用紫外分光光度计测定各样液的吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出标准曲线；2)测定待测样品多糖含量：提取的大肥菇粗多糖，取多糖于150mL容量瓶中定容，...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦迎春，刘文卓，吴杉，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海,63