稳定表达人内源性INav的细胞模型及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，采用一个宿主细胞，宿主细胞中含有dCas9‑VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；dCas9‑VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，SCN5A的引导RNA的序列如SEQ ID NO.2所示。还提供了上述细胞模型的制备方法，将dCas9‑VP64融合蛋白和SCN5A‑gRNA分别构建到载体上，然后分别包装成病毒，将上述的病毒感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。本发明专利技术在SCN5A启动子区域转录激活内源性人SCN5A基因，增加其表达，发挥通道功能，为进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。

Cell model for stable expression of human endogenous INav and preparation method and use thereof

The present invention provides a cell model for the stable expression of human endogenous INav, using a host cell, the host cell containing the guiding RNA of the dCas9 VP64 fusion protein and SCN5A; the sequence of the dCas9 VP64 fusion protein, as shown by SEQ ID ID NO.1, is shown in the sequence of SCN5A guiding RNA. The preparation method of the above cell model was also provided. The dCas9 VP64 fusion protein and SCN5A gRNA were constructed on the vector respectively. Then the virus was packaged respectively. The virus infected the host cells and screened the positive clones, that is, the cell model of the endogenous INav was expressed steadily. The present invention activates the endogenous human SCN5A gene in the SCN5A promoter region, increasing its expression and exerting channel function, which brings a lot of convenience for high throughput screening in vitro.

【技术实现步骤摘要】
稳定表达人内源性INav的细胞模型及其制备方法和用途
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种细胞模型，具体来说是一种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用。
技术介绍
离子通道是细胞膜上的孔道蛋白，是细胞生物电的基础。钠离子通道广泛存在于可兴奋细胞中，维持细胞的兴奋性和正常生理功能。电压依赖性的钠通道(INav)主要存在于心房肌、心室肌和希浦系统的细胞膜上，参与动作电位0相去极化及2相平台期，决定细胞的兴奋性和传导性。SCN5A基因编码INav通道的α亚基，其基因突变会引起INav功能异常，是引起多种恶性心律失常的重要原因，也是开发治疗心律失常药物的靶点，因此深入研究INav通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。利用膜片钳技术记录透过离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道的分子活动，能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，广泛应用于药物化合物的筛选。HEK293细胞是来源于人胚肾细胞的细胞系，其转染效率高，胞体大，广泛应用于细胞电生理的研究。目前利用人源性细胞进行药物的高通量筛选存在以下问题：1)人的组织样本来源困难、个体差异大；2)外源离子通道基因稳转到人源细胞系中，缺乏通道基因的可变剪切形式，可能与内源性基因的调控方式不一致；3)形成的通道电流变异度高，无法进行高通量筛选。因此，需要建立体外稳定表达的人内源性细胞模型，助力药物的稳定高效筛选。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用，所述的这种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用要解决现有技术中的人源性细胞无法进行药物的高通量筛选的技术问题。本专利技术提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，采用一个宿主细胞，所述的宿主细胞中含有dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；所述的dCas9-VP64融合蛋白的序列如SEQIDNO.1所示，所述的SCN5A的引导RNA的序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，所述的宿主细胞为HEK293细胞。本专利技术还提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法，将dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A-gRNA分别构建到载体上，然后分别包装成病毒，将上述的病毒感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。进一步的，将dCas9-VP64融合蛋白构建到pLVX-Puro载体上，获得pLVX-dCas9-VP64-Puro载体，将SCN5A-gRNA构建到pLVX-shRNA2载体上，获得pLVX-SCN5A-gRNA-Zsgreen1载体，用三质粒包装系统将pLVX-dCas9-VP64-Puro与psPAX2和pMD2.G三个质粒共转包装成病毒，用三质粒包装系统将pLVX-SCN5A-gRNA-Zsgreen1与psPAX2和pMD2.G三个质粒共转包装成病毒，将上述的两个病毒同时感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。进一步的，所述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法包括：1)全基因合成dCas9-VP64，将dCas9-VP64插入到pLVX-Puro载体的XhoI和EcoRI之间；2)筛选和合成有效的SCN5A-gRNA片段，将SCN5A-gRNA片段插入到pLVX-shRNA2；3)将步骤1)和步骤2)插入后的载体分别包装成慢病毒；4)使用慢病毒分别感染HEK293细胞，用嘌呤霉素和绿色荧光筛选出阳性克隆，获得稳定表达人内源性INav的细胞模型。本专利技术还提供了上述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型在体外高通量筛选药物中的应用。具体的，所述药物包括治疗心律失常的药物。本专利技术提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，它有利于药物的稳定高效筛选。本专利技术的稳定表达人内源性INav的细胞模型，以HEK293细胞为宿主细胞，包含有dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA(guideRNA，gRNA)。本专利技术通过将转录激活的效应质粒dCas9-VP64和特异性的引导质粒SCN5A-gRNA共同转染到HEK293细胞中，在SCN5A启动子区域转录激活内源性人SCN5A基因，增加其表达，发挥通道功能，成功建立了体外稳定表达SCN5A的HEK293细胞模型，为进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术利用HEK293细胞建立稳转细胞模型，成功建立了人源性细胞的筛选平台，更接近临床药物筛选。本专利技术通过建立dCas9-VP64融合蛋白在HEK293细胞中稳定表达，为引入其他特异性引导RNA，建立其他离子通道的内源性表达提供了基础。本专利技术通过检测Zsgreen1绿色荧光，能够快速、高效地筛选表达通道且有通道功能的阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的时间和人力。本专利技术通过转录激活内源性人SCN5A基因，能够生成多种人SCN5A基因的转录剪接体，能够更好的模拟人源性细胞中的基因转录模式。附图说明图1是dCas9-VP64载体和SCN5A-gRNA载体的构建及作用方式。图2是dCas9-VP64/SCN5A-gRNA共转后SCN5AmRNA的表达。图3是dCas9-VP64/SCN5A-gRNA共转后其他离子通道的表达。图4是HEK293细胞中内源性SCN5A的mRNA剪接体的表达。图5是dCas9-VP64稳转HEK293细胞中的表达。图6是手动膜片钳在HEK293细胞上记录到的INav1.5的原始电流图。图7是手动膜片钳记录到的INav1.5通道的电流-电压关系曲线。具体实施方式为对本专利技术的
技术实现思路
、特点与功效有更具体的了解，现结合图示的实施方式，详述如下：实施例1质粒载体构建(如图1所示)1.dCas9-VP64载体构建(1)全基因合成dCas9-VP64(如SEQIDNO.1所示)，使用重组酶法连接到pLVX-Puro载体的XhoI和EcoRI之间；采用的引物如下：Forward：ctaccggactcagatctcgagatgaaaaggccggcggccReverse：gtaccgtcgactgcagaattctcacagcatgtccaggtcga(2)在50μl的反应体系中，37℃，用XhoI和EcoRI双酶切载体pLVX-Puro，跑胶纯化。(3)在20μl的反应体系中，37℃，用同源重组酶(IIOneStepCloningKit，Vazyme)把dCas9-VP64连接到载体pLVX-Puro上。(4)连接产物转化到DH5α感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani)培养基平板上，37℃培养14h后，挑单克隆进行菌落PCR：20μl的反应体系，94℃变性，58℃退火，72℃延伸，30个循环；鉴定，并测序阳性克隆。2.SCN5A-gRNA载体构建(1)合成有效的gRNA片段(如SEQIDNO.2所示)使用人U6启动子表达框，其中，U6启动子的序列为：tttcccatg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，其特征在于：采用一个宿主细胞，所述的宿主细胞中含有dCas9‑VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；所述的dCas9‑VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SCN5A的引导RNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
2018.01.15 CN 20181003350561.一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，其特征在于：采用一个宿主细胞，所述的宿主细胞中含有dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；所述的dCas9-VP64融合蛋白的序列如SEQIDNO.1所示，所述的SCN5A的引导RNA的序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，其特征在于：所述的宿主细胞为HEK293细胞。3.权利要求1所述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法，其特征在于：将dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A-gRNA分别构建到载体上，然后分别包装成病毒，将上述的病毒感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。4.根据权利要求3所述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法，其特征在于：将dCas9-VP64融合蛋白构建到pLVX-Puro载体上，获得pLVX-dCas9-VP64-Puro载体，将SCN5A-gRNA构建到pLVX-shRNA2载体上，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义汉，徐亮，高斯韵，唐秋雨，石蕊，黄家乐，
申请(专利权)人：上海市东方医院，
类型：发明
国别省市：上海,31