SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2及建立方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1（Hertwig`s epithelial root sheath,HERS‑H1）和HERS‑C2（Hertwig`s epithelial root sheath,HERS‑C2）的建立方法及其在牙再生中的应用，其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑C2保藏号为CCTCC NO.C2017250。本发明专利技术中细胞系保存了牙齿发育过程中原代赫特维希上皮根鞘细胞的特性，并且可以至少传代至50代，增殖速率较原代细胞大为提高。建立方法操作简单，稳定、重复性高。

Establishment and application of HERS-H1 and HERS-C2 in SD rat epithelial root sheath cell line HERS-H1

The invention belongs to the field of biological technology, which involves the establishment of the Hertwig epithelial root sheath cell line HERS H1 (Hertwig`s epithelial root sheath, HERS H1) and HERS C2 C2 (Hertwig`s HERS) and its application in tooth regeneration. The characteristic is: the upper root of Hertwig's upper root. The sheath cell line HERS H1 CCTCC is CCTCC NO.C2017249, and the Hertwig epithelial root sheath cell line HERS C2 C2 is CCTCC NO.C2017250. In the present invention, the cell line preserves the characteristics of the DEI Hertwig epithelial root sheath cells in the process of the development of the teeth, and can be passed to at least 50 generations, and the proliferation rate is higher than that of the primary cells. The method is simple, stable and reproducible.

【技术实现步骤摘要】
SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2及建立方法及应用
本专利技术属于生物
，涉及SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法及应用。
技术介绍
牙齿是人类重要的器官，承担着咀嚼、发音、维持颌面部形态等功能，然而牙齿缺失成为影响人类生活的一大因素。20-64岁的成人平均仅有24.92颗牙齿存留，平均每人缺失了3.08颗牙齿(尽头牙除外)。而其中有3.75％的人全口缺牙。目前修复缺失牙齿的方法主要有桥体修复，种植牙修复以及活动义齿修复。桥体修复和活动义齿修复主要是依赖于余留的牙齿对缺失的牙齿进行修复，往往会对余留的牙齿造成不可逆转的损伤，假牙的舒适度也不尽如人意。目前主流的修复方式为种植义齿修复，既舒适又美观，但种植体周围很容易发生炎症，造成种植义齿松动脱落。因此，构建功能完好的生物牙根以及在生物牙根上安装牙冠，构建能媲美天然牙齿的修复体已成为修复缺失牙齿的趋势。赫特维希上皮根鞘(Hertwig’sepithelialrootsheath,HERS)是牙冠发育完成后，成釉器内外釉上皮在颈环处增生，向未来根尖孔方向生长，形成的双层上皮结构，牙根是在HERS和周围外胚间充质的相互作用下形成的。因此，HERS作为调控牙根发育的重要结构，对于构建生物牙根以及探究牙根发育过程中的分子机制起到至关重要的作用。然而由于HERS在牙根发育中是暂时性结构，而且仅由两层上皮细胞构成且被外胚间充质细胞包饶，故从牙胚中单独分离HERS细胞非常困难并且细胞数目较少。分离得到的HERS细胞的细胞间连接较紧密，使用常用的胰蛋白酶进行消化，需要消化较长时间才能使细胞离散，而胰蛋白酶长时间作用于细胞，对细胞损伤较大，造成HERS细胞难以培养、扩增、不易诱导及传代效果差等不足，因而为了便于探究牙根发育的分子机制以及利用HERS细胞构建生物牙根，就必须得到能够稳定传代扩增的HERS细胞。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1(Hertwig`sepithelialrootsheath,HERS-H1)和HERS-C2(Hertwig`sepithelialrootsheath,HERS-C2)的建立方法及应用，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCCNO.C2017249，保藏日期是2017年11月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心；所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCCNO.C2017250，保藏日期是2017年11月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心；建立了SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2，并用该细胞系实现了牙骨质再生，为研究牙根发育的分子机制以及构建生物牙根提供了物质基础。解决以上技术问题的本专利技术中的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2，其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCCNO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCCNO.C2017250。本专利技术中SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，包括如下步骤：(1)获取大鼠原代HERS细胞；(2)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞；(3)制备单细胞悬液及克隆扩增培养即得。所述步骤(1)中采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶，1-2.5U/mL分散酶和300-800U/mLⅠ型胶原酶的比例为1-1.2：1。本专利技术中构建方法的优化方案中还包括以下步骤：(1)编码SV40LT慢病毒转染原代细胞，进行传代培养；(2)用含嘌呤霉素的培养基筛选转染阳性的细胞；(3)阳性转染的单细胞克隆扩增后传代培养至50代或以上，获得HERS-H1和HERS-C2细胞系；(3)对HERS-H1和HERS-C2细胞系进行表面标记蛋白的免疫荧光检测；(4)诱导液诱导其上皮间充质转化或成骨分化。所述步骤(1)中当原代HERS细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，纯化后的HERS细胞进行传代培养；当传代的细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基进行培养，慢病毒在培养基中浓度5×105TU/ml。所述慢病毒中编码SV40LT的序列如SEQIDNO.1所示。所述上皮培养基为在含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的基础培养基中加入2％体积比胎牛血清和1％体积比的上皮细胞生长因子的培养基，基础培养基为DMEM/F12。所述上皮细胞生长因子为上皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、胰岛素等因子或美国Sciencell公司提供的上皮培养基中的上皮细胞生长因子。所述嘌呤霉素浓度为1-5μg/ml。所述诱导液为成骨诱导液或含TGFβ1的成骨诱导液，其中成骨诱导液中包括以下重量的组份：10-8M地塞米松，50μg/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠，3mMCaCl2，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素；所述TGFβ1浓度为2-15ng/ml。所述免疫荧光检测中将E-cadherin,Vimentin,CK14作为HERS细胞鉴定标记物。所述扩增引物组及序列如下：所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2在构建生物牙根中的应用。所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1及HERS-C2在构建完整牙胚中的应用。细胞系HERS-H1及HERS-C2可以发生上皮间充质转化及可以分化为具有形成矿化组织能力的成牙骨质细胞,也可以分化为具有形成牙周膜纤维能力的成纤维细胞及诱导牙乳头细胞分化形成牙本质。本专利技术中SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，具体步骤如下：(1)采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶:选择出生后6-10天的SD大鼠乳鼠，麻醉后经2道75％乙醇消毒，分离上颌骨和下颌骨，剥离下颌第一磨牙完整牙胚，沿牙冠钙化边缘切下约1mm牙颈部组织，PBS冲洗后剪碎至乳糜状；用混合酶(胶原酶和Dispase酶混合)消化液对组织进行消化，置于37℃水浴锅中消化30分钟，每隔10分钟摇晃一次；用含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，PBS缓冲液洗涤，离心，去上清；再用培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养；第二天补充适量培养液至稍稍浸没组织块，视细胞生长情况进行适当换液。(2)当上皮细胞形成集落时用胰蛋白酶消化去除间充质细胞以纯化HERS细胞，细胞密度达到约70-90％的时候进行传代培养：弃培养液，用1×PBS洗一次，加入胰蛋白酶消化3-6分钟；PBS洗去间充质细胞，重复2-4次；重新加胰酶，37℃放置5-10分钟；吹打细胞，置于离心管中，加入适量的培养液吹打、离心、弃上清，加入适量培养液吹打散；将细胞悬液加入新的培养皿中，得到所述大鼠赫特维希上皮根鞘原代细胞(3)当传代细胞密度达到70％时更换为含编码SV40LT慢病毒的上皮培养基；(4)用含嘌呤霉素的上皮培养基筛选转染阳性的HERS本文档来自技高网...

【技术保护点】
SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1（Hertwig`s epithelial root sheath, HERS‑H1）和HERS‑C2（Hertwig`s epithelial root sheath, HERS‑C2），其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS‑H1保藏号为CCTCC NO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系 HERS‑C2保藏号为CCTCC NO.C2017250。

【技术特征摘要】
1.SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1（Hertwig`sepithelialrootsheath,HERS-H1）和HERS-C2（Hertwig`sepithelialrootsheath,HERS-C2），其特征在于：所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1保藏号为CCTCCNO.C2017249，所述赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-C2保藏号为CCTCCNO.C2017250。2.根据权利要求1所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）获取大鼠原代HERS细胞；（2）编码SV40LT慢病毒转染原代细胞；（3）制备单细胞悬液及克隆扩增培养即得。3.根据权利要求1所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用混合酶消化法进行赫特维希上皮根鞘细胞的原代培养；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型胶原酶，分散酶和Ⅰ型胶原酶的比例为1-1.2：1。4.根据权利要求1-3中任一项所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：还包括以下步骤：（1）编码SV40LT慢病毒转染原代细胞，进行传代培养；（2）用含嘌呤霉素的培养基筛选转染阳性的细胞；（3）阳性转染的单细胞克隆扩增后传代培养至50代或以上，获得HERS-H1和HERS-C2细胞系；（3）对HERS-H1和HERS-C2细胞系进行表面标记蛋白的免疫荧光检测；（4）诱导液诱导其上皮间充质转化或成骨分化。5.根据权利要求4所述的SD大鼠赫特维希上皮根鞘细胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述步骤（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国庆，田卫东，李雪冰，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51