本发明专利技术公开了一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型及其建立方法与应用，属于体外高通量药物筛选领域。本发明专利技术公开的细胞模型为以COS7细胞为宿主细胞，包含KCNJ2基因表达系统。通过将KCNJ2基因连入载体上，再将载体转染进入COS7细胞进行筛选得到该细胞模型。本发明专利技术通过将组成编码Ik1通道蛋白的KCNJ2基因转染到COS7中，建立了体外稳定表达KCNJ2细胞模型，为药物的体外高通量筛选提供了一种新的高效途径。
Cell model for stable expression of human cardiac myocyte IK1 and its establishment and Application
The present invention discloses a cell model for stable expression of human cardiac myocyte IK1 and its establishment method and application, belonging to the field of high-throughput drug screening in vitro. The cell model disclosed is COS7 cells as host cells, including KCNJ2 gene expression system. The KCNJ2 gene was inserted into the vector and transfected into COS7 cells to screen the cell model. By transfecting the KCNJ2 gene of the encoded Ik1 channel protein into COS7, the present invention establishes a stable expression of KCNJ2 cell model in vitro, which provides a new efficient way for high throughput screening of drugs in vitro.
【技术实现步骤摘要】
稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型及其建立方法与应用
本专利技术涉及体外高通量药物筛选领域，特别是涉及一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型及其建立方法与应用。
技术介绍
离子通道是细胞膜上的一类能够运输离子跨膜流动的蛋白质孔道，是细胞信息传递的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白，在很多的生理过程中起到非常关键的作用。内向整流钾通道(Ik1)在心脏电生理活动中起到非常关键的作用，参与人心肌细胞动作电位复极，特别是平台期形成与维持重要外向离子流。IK1通道是由KCNJ2编码的kir2.1蛋白组成。KCNJ2基因突变会引起IK1通道功能异常，是多种恶性心律失常的重要原因，深入研究IK1通道特性、药理特性及其调节机制将有可能为此类心律失常的防治提供新的线索。由于人心肌细胞上IK1电流密度小，且存在多种类似钾通道电流成分干扰，以及组织标本来源困难等原因，导致直接使用人心肌细胞对药物的高通量筛选来说不太合适，因此建立体外的稳定表达的IK1细胞模型具有很大的价值，有利于药物的稳定高效筛选。COS-7是来源于非洲绿猴肾成纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系，能组成型地表达SV40T抗原，使得任何复制启始位置带有SV40启动子的转染质粒能够以很高的拷贝数进行复制，广泛应用于生物医学领域以及商业化的治疗蛋白的生产。由于COS7本身离子通道蛋白少，干扰少，增殖快，易于遗传操作等特别，特别适用于外源表达离子通道蛋白，用于药物选择。电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道在在细胞表面正确表达且发挥功能的标准方法。传统的手动膜片钳技术能够很好的研究细胞表面的离子通道作用，但是由于通量小，效率低，不能进行大量的克隆筛选及药物化合物的筛选，很难成为细胞克隆初期筛选的最好的实验方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术存在的技术问题，提供一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型及其建立方法与应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术的目的之一是提供一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型，以有利于药物的稳定高效筛选。该细胞模型以COS7细胞为宿主细胞，包含KCNJ2基因表达系统。所述表达系统优选为杆状病毒表达系统(BacMam系统)。本专利技术的目的之二是提供上述细胞模型的建立方法，步骤包括：将KCNJ2基因连入载体上，再将载体转染进入COS7细胞进行筛选。优选的，所述载体包括pFasBac载体。将KCNJ2基因连入载体上的步骤包括：1)以人心肌细胞cDNA为模板扩增出KCNJ2基因片段，在基因片段5’末端引入了酶切位点HindIII，3’端引入了酶切位点BamHI；2)用HindIII跟BamHI双酶切pFasBac载体以及片段KCNJ2；3)用T4DNA连接酶将酶切后的KCNJ2片段连入pFasBac载体上；本专利技术的目的之三是提供上述细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用；所述药物包括治疗心律失常疾病的药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过将KCNJ2基因转入COS7细胞表达，发挥通道功能，成功建立了体外稳定表达KCNJ2的COS7细胞模型，对进行体外药物高通量筛选带来了许多便捷。2、本专利技术使用膜电位试剂盒，通过FLIRP检查荧光信号值，能够快速、高效地筛选出表达通道且有通道功能的阳性克隆，为电生理实验提供有针对性的克隆候选者，从而能够节省大量的时间跟人力，是一种很好的高通量筛选途径。附图说明图1是FLIPR检测本专利技术所构建细胞得到的反应信号图。图2是手动膜片钳在本专利技术所构建细胞上记录到的IK1原始电流图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式做进一步描述。以下实施仅用于更加清楚的说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1质粒载体构建1、以人心肌细胞cDNA为模板扩增出KCNJ2基因片段，在基因片段5’末端引入了酶切位点HindIII，3’端引入了酶切位点BamHI。所用引物序列为：F1：atcgaagcttatgggcagtgtgcgaacc，R1：tcgaggatcctcatatctccgactct。2、在30μL的反应体系中，用HindIII和BamHI双酶切pFasBacTM1和片段KCNJ2，反应条件为37℃4h。3、在10μL的反应体系中，22℃用T4DNA连接酶将酶切片段KCNJ2连入酶切的pFasBacTM1载体上。4、连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂在含有氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养15hours后，挑取单个克隆放大培养，提取质粒进行鉴定，并测序(测序结果见SEQIDNO.3)得到阳性克隆，所构建的重组载体命名为pFasBac-KCNJ2。实施例2细胞株的构建1、转染前24小时，将COS7细胞通过胰酶消化并计数，铺在6孔板(细胞数目为1×106)中，加入2mL含10％胎牛血清的液体DMEM培养基培养过夜。2、将2μg重组载体pFasBac-KCNJ2以及4μL的invitrogeng公司lipo2000转染试剂转染入细胞中，37℃培养48小时。3、用胰酶消化转染48小时的细胞，全部转移至含有10mL含10％胎牛血清的液体DMEM培养基的10cm细胞培养皿中，用含有800μg/mLG418的含10％胎牛血清的液体DMEM培养基筛选。4、筛选2-3周后直至没有细胞再漂浮死亡的现象，将细胞消化计数，加入96孔板(100μL含800μg/mLG418及10％胎牛血清的液体DMEM培养基)进行单克隆的培养。5、培养2周后，在显微镜下挑取单个克隆的细胞孔，用含300μg/mLG418及10％胎牛血清的液体DMEM培养基维持。实施例3细胞株功能验证1、通过FLIPR检测：按照MolecularDevices公司FLIPR膜电位检测试剂盒说明书提供的步骤，检测挑选出的克隆，结果见如图1，阴性克隆其相对荧光单位略低于0，阳性克隆相对荧光单位在30s之前上升很快，达到250后续上升减缓，在200s时能超过400。挑取部分阳性克隆通过电生理实验进一步鉴定。2、电生理检测：通过改变电压，采用手动全细胞膜片钳的方法，在室温情况下记录钾电流，上述挑取的阳性克隆呈现出典型的IK1电流形态，结果见图2。以上对本专利技术的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本专利技术并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本专利技术的范畴之中。因此，在不脱离本专利技术的精神和范围内所作的均等变换和修改，都应涵盖在本专利技术的范围内。序列表<110>湖北工业大学<120>稳定表达人心肌细胞I<sub>K1</sub>的细胞模型及其建立方法与应用<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1a本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型，其特征在于：所述细胞模型以COS7细胞为宿主细胞，包含KCNJ2基因表达系统。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达人心肌细胞IK1的细胞模型，其特征在于：所述细胞模型以COS7细胞为宿主细胞，包含KCNJ2基因表达系统。2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述表达系统为杆状病毒表达系统。3.权利要求1所述的细胞模型的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：将KCNJ2基因连入载体上，再将载体转染进入COS7细胞进行筛选。4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于：所述载体包括pFasBac载体。5.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄渊，唐景峰，陈兴珍，周策凡，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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