一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。该抗肿瘤NK细胞为经嵌合共刺激转换受体改造的NK细胞；所述的嵌合共刺激转换受体由PD‑1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。本发明专利技术所述的抗肿瘤NK细胞，采用嵌合共刺激转换受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。

A new anti-tumor NK cell and its preparation and Application

The invention discloses a novel anti-tumor NK cell and a preparation method and application thereof. The anti tumor NK cell is a NK cell transformed by a co stimulated conversion receptor, and the chimeric co stimulating receptor is composed of the PD extracellular segment, the NKG2D transmembrane and the intracellular segment, and the 41BB intracellular segment of the co stimulator. The anti tumor NK cells described in the present invention can improve the anti tumor effect of the NK cells by using the chimeric co stimulation conversion receptor to improve the antitumor effect of the NK cells, realize the specific identification and killing of the solid tumor, and do not cause an immune response to the body's excesses.

【技术实现步骤摘要】
一种新型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体的说，涉及一种新型的抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目，特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞(CAR-T)，在血液系统恶性肿瘤的临床治疗展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，使之成为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破。然而，尽管CAR-T技术研发不断取得进步，但依然面临着诸多挑战，主要障碍之一为CAR-T虽然具备强大的杀死癌细胞的能力，但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命。并且无论CAR-T或是TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等免疫细胞技术，迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效，而治疗实体瘤恰是抗肿瘤的真正主战场。因此，如何克服CAR-T技术的弊端以及如何能赋予免疫细胞对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，成为免疫细胞治疗亟待解决的问题。NK细胞(自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10％。NK细胞在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用，为机体抵抗肿瘤的第一道防线，利用NK细胞进行临床治疗已有较长历史。与T细胞相比，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势：一是NK细胞具有不受HLA(人白细胞抗原)限制的非特异性肿瘤细胞杀伤作用，主要通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF(肿瘤坏死因子)等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，避免造成致死性细胞因子风暴；二是NK细胞还可通过CD16与抗体Fc片段结合，诱发ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)的特异性杀伤作用；三是NK细胞的杀伤作用具有连续性，可从一个目标移向另一个目标，杀死多达7～10个肿瘤细胞，而T细胞缺乏这种连续杀伤性；四是NK细胞寿命短暂，发挥功效后很快会消失，无需考虑类似CAR-T细胞需要自杀基因来限制其持久副作用。由于这些有利因素，NK细胞用于患者治疗时有效并且安全。免疫检查点是指一类免疫抑制性分子，通过共抑制或共刺激信号一系列途径来调节免疫细胞活性，防止过度免疫激活和确保自身耐受，从而避免正常组织损伤和破坏。PD-1(程序性细胞死亡蛋白-1)是其中一个主要的抑制分子，它具有一个ITSM(免疫受体酪氨酸转换基序)结构，在与配体PD-L1结合后能够磷酸化并引发胞内SHP-2酪氨酸磷酸酶，从而引发抗原受体复合体的去磷酸化。因此，由PD-1/PD-L1介导免疫负调控机制可以抑制MHC-TCR信号通路的激活，控制T细胞和NK细胞的增殖、细胞因子分泌或对同类抗原的应答反应。大量研究证据表明，PD-1主要表达于活化的免疫细胞表面，其配体PD-L1在正常组织中表达有限，但在大部分实体瘤细胞和免疫抑制细胞的表达显著增加，肿瘤利用PD-1/PD-L1负调控机制实现对抗肿瘤免疫反应的逃逸。因此，阻断这条免疫抑制信号通路成为实体瘤免疫治疗是一个重要路径。目前多项临床前研究和临床试验均指出，采用PD-L1或PD-1阻断抗体来增强癌症患者的抗肿瘤免疫应答可作为一种新型的肿瘤免疫治疗手段，并能够获得持续性的临床应答。更有意义的是，研究发现利用PD-1细胞外段和CD28跨膜段及胞内段，构建一个嵌合共刺激开关受体，将其引入针对实体瘤靶抗原的CAR-T细胞，相比现在单独使用PD-1抗体治疗或CAR-T细胞治疗，都有更好的效果。还有研究表明，联合使用PD-1抗体和41BB(CD137)抗体，对治疗小鼠黑色素瘤模型和结肠癌模型具有很好的效果，显著抑制肿瘤生长。事实上41BB与PD-1都是一个需要诱导才会表达的蛋白，当41BB抗体与41BBL配体结合，可激活T细胞和NK细胞的活化、增殖及其它功能。NK细胞的免疫监视功能取决于表面抑制性受体和活化性受体所传递信号的整合。NK细胞受体NKG2D是活化性受体之一，NKG2D的单独活化足以刺激NK细胞的活化增殖，并能克服抑制性受体的强势信号，嵌合共刺激受体联合NKG2D增强了NK细胞的活性及对肿瘤细胞的杀伤效应。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于，提供一种新型的抗肿瘤NK细胞，其采用嵌合共刺激转换受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。本专利技术的另一个目的在于，提供所述抗肿瘤NK细胞的制备方法。本专利技术的再一个目的在于，提供所述抗肿瘤NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗肿瘤NK细胞，其为经嵌合共刺激转换受体(ChimericCostimulationConvertingReceptor，CCCR)改造的NK细胞。进一步地，所述的嵌合共刺激转换受体(CCCR)由PD-1胞外段(21-170aa)、NKG2D跨膜及胞内段(44-132aa)，以及共刺激分子41BB胞内段(214-255aa)组成。进一步地，所述嵌合共刺激转换受体(CCCR)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。进一步地，所述PD-1胞外段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示。进一步地，所述NKG2D跨膜及胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:5所示。进一步地，所述共刺激分子41BB胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:7所示。本专利技术设计了嵌合共刺激转换受体(CCCR)，其分子模块构建采用NKG2D跨膜及胞内段(44-132aa)以及共刺激分子4-1BB胞内段(214-255aa)替换了PD-1受体的胞内抑制信号域，只保留PD-1分子的胞外域(21-170aa)。当CCCR的PD-1胞外信号域识别到肿瘤细胞上的PD-L1分子时，信号下传，一方面经由跨膜区的NKG2D同源二聚体与DAP10(NKG2D的配体之一)双二聚体结合而成的六聚体结构(NKG2D-DAP10复合体)，其中DAP10作为衔接蛋白招募Pi3K的p85亚基和Grb2-Vav1复合体，进而引发下游蛋白(如SLP-76与PLC-γ2)的酪氨酸磷酸化，使得激活信号持续下传，引起完全的钙释放和细胞毒性，从而激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。另一方面，PD-1/PD-L1识别信号经NKG2D传递到共刺激分子41BB(CD137)胞内段时，41BB通过招募TRAF1-3蛋白将共刺激信号由多条常见信号途径，如Pi3K/AKT、IKK/NF-κB、JNK等向下游传递，促进颗粒酶B、穿孔素和FasL基因的表达，从而提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，尤其是41BB与DAP10在下游信号通路Pi3K/AKT上可能发生重叠，这种信号的叠加作用将进一步增强NK细胞抗肿瘤活性。综上，本专利技术利用CCCR这一嵌合分子模块发挥信号转换“开关”作用，从而逆转PD-1/PD-L1免疫负调控机制，即把PD-1/PD-L1负调控信号转变成触发NKG2D活化性受体通路的正向激活信号，并在41BB协同作用下，大大增强NK细胞抗肿瘤治疗的效果。经实验证明，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤NK细胞，其特征在于：其为经嵌合共刺激转换受体改造的NK细胞；所述的嵌合共刺激转换受体由PD‑1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤NK细胞，其特征在于：其为经嵌合共刺激转换受体改造的NK细胞；所述的嵌合共刺激转换受体由PD-1胞外段、NKG2D跨膜及胞内段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。2.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述嵌合共刺激转换受体的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述PD-1胞外段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述NKG2D跨膜及胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:5所示。5.根据权利要求1所述的抗肿瘤NK细胞，其特征在于：所述共刺激分子41BB胞内段的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:8所示；其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱武凌，路臣桂，张会勇，李冬贝，郭长江，李明凤，夏文姣，王晓银，吕探宇，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41