工程化植酸酶及其使用方法技术

提供了通过将结合元件与目标植酸酶融合用于增强植酸酶热稳定性的方法。描述了包括融合至目标植酸酶以引起工程化植酸酶环化的结合元件并且增强目标植酸酶的热稳定性的工程化植酸酶。还提供了编码工程化植酸酶的工程化核酸和经工程化以表达工程化核酸的宿主。描述了用于将工程化植酸酶掺入动物饲料的方法和包括工程化植酸酶的动物饲料。

Engineering phytase and its use method

A method for enhancing thermostability of phytase by fusion of binding elements and target phytase is provided. The engineered phytase, which consists of a combination of the fused elements that fused to the target phytase to cause engineering phytase cyclization and to enhance the thermal stability of the target phytase, is described. Engineered nucleic acids encoding engineered phytase and host engineered to express engineered nucleic acids are also provided. A method for the incorporation of engineered phytase into animal feed and animal feed containing engineered phytase are described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化植酸酶及其使用方法相关申请的交叉引证本申请要求于2015年9月18日提交的美国临时申请第62/220,688号的权益，如同所充分阐述的，其通过引证结合至本文。与本申请一起电子提交的序列表以“序列表”为标题，创建于2016年9月18日，并且具有399,733字节的文件大小，如同所充分阐述的，该序列表通过引证结合至本文。
本公开涉及工程化植酸酶分子(其具有改善的热稳定性，改善的或降低的胃稳定性)，编码其的核酸，其制备方法，以及使用其在工业加工或动物饲料中的方法。本公开涉及表达具有改善的热稳定性的植酸酶的转基因植物，编码该植酸酶的核酸，以及加工该转基因植物与组织，和生产和利用动物饲料的方法。本公开还涉及含有植酸酶的饲料添加剂、谷物和纤维加工添加剂。本公开涉及工程化大肠杆菌来源的植酸酶的形式，其已经被改性以改善它们作为单胃和反刍动物饲料组分的性能。这些改性的植酸酶可以直接在饲料组分，如玉米粒中表达，并且掺入动物饲料中，例如掺入单胃动物的饲料(mash)或颗粒饲料中，或者掺入反刍动物的青贮饲料或谷物中。含有表达植酸酶的这些植物的日粮支持有效的动物生长，且相比没有工程化植酸酶时所必需的磷酸盐更少的磷酸盐。
技术介绍
植酸酶是一类从植酸中水解磷酸盐以产生游离的磷酸盐和肌醇的酸性磷酸酶。植酸(肌醇六磷酸)，或其去质子化形式，植酸盐在许多动物饲料组分，如谷物和豆类中很常见，并且可以代表这些饲料中总磷酸盐含量的显著部分。然而，许多家畜不能有效消化植酸，因此不能吸收磷酸盐。因此，必须将其它形式的磷酸盐，如岩石磷酸盐或磷酸钙添加到动物饲料中以提供这种关键营养素。此外，植酸作为饮食中的抗营养元素，与蛋白质和螯合矿物质，如铁、钙和镁结合，阻止了这些物质的吸收。由于未消化的植酸和过量的无机磷酸盐可以排泄在粪便中，它们可以作为农业径流(agriculturalrun-off)中磷酸盐污染的重要来源。植酸酶通常用于工业加工和动物生产。在动物饲料中添加植酸酶可以降低添加无机磷酸盐的需求，增加动物对磷酸盐、蛋白质和矿物质的吸收，并减少农业径流中的磷酸盐污染。当这些效应结合起来时，可以显著提高动物生长的效率以及从它们所消耗的饲料中获得的总营养。在工业过程中，特别是发酵过程中，植酸酶常用于水解植酸盐，使矿物质和其他营养物质释放进入发酵，以及通过需要辅因子(被植酸盐螯合的(sequestered))的酶来增强淀粉降解(E.Khullar,J.K.Shetty,M.E.Tumbleson,V.Singh，“UseofPhytasesinEthanolProductionfromE-MillCornProcessing,”CerealChem.,88(3):223-227,2011，如同所充分阐述的，其通过引证结合至本文)。它在工业上也用于减少可能与发酵或相关过程中经常发生的和植酸盐或磷酸盐积聚(有时称为“啤酒石”)有关的结垢。在动物生产和营养方面，对于营养学上可行的由植酸盐制备磷的一个策略是向动物饲料中添加植酸酶(Jongbloed和Lenis,1998；Onyango等，2005，如同所充分阐述的，两者均通过引证结合至本文)。已经表明，在家禽和猪的日粮中使用植酸酶提高了性能和磷利用率(Baker，2002；Nyannor等，2007和2009，如同所充分阐述的，两者都通过引证结合至本文)。目前市场上有多种植酸酶产品用于此用途，包括NatuphosTM(BASF)，来源于黑曲霉的植酸酶，RonozymeTM(DSM)，来源于隔孢伏革菌(Peniophoralycii)的植酸酶，以及来源于大肠杆菌的Quantum和QuantumBlue(ABVista)植酸酶。在动物饲料中使用植酸酶可以减少添加到动物饲料中的无机磷的量，并且据报导，粪便磷降低了最高达56％(Nahm，2002；Sharpley等，1994；Wodzinski和Wodzinski等，Ullah，1996，如同所充分阐述的，所有这些通过引证结合至本文)。尽管在动物饲料和工业加工中使用植酸酶是有益的，但在动物饲料日粮中使用微生物或植物产生的植酸酶的一个常见的挑战是这些植酸酶在通常用于制备饲料颗粒的调节(conditioning)、挤出或造粒过程中无法保持全部活性。尽管已经设计了一些酶来改善植酸酶的热稳定性，但是大多数酶在造粒期间会失去活性，增加了它们的相对成本并且降低了酶的功效。因此需要具有进一步改善的热稳定性的酶，特别是当饲料制造商更喜欢使用较高温度的造粒工艺时。本领域众所周知的是，许多生物分子可以通过暴露于高温而变得无活性。由于蛋白质在自然界普遍存在，发生在所有生命界中，并且存在于嗜温菌和嗜热菌多种生物体中，因此它们具有巨大的热稳定性范围。以具有低热稳定性为特征的蛋白质通常通过分子途径进行发展，在分子途径中，它们的结构能量增加，增加了分子振动和运动，这克服了分子内结合力并导致蛋白质展开。当发生展开时，蛋白质内部的结构是无序的，同时暴露蛋白质结构中的亲水和疏水区域以及氨基酸，并且通常导致蛋白聚集。对于具有低热稳定性的蛋白，展开过程通常比重折叠过程快得多，并且在某些情况下可能基本上是不可逆的。相反，具有高度热稳定性的蛋白质通常具有更高程度的分子内键合，在存在增加的热能水平时，这有助于将它们的结构保持在一起，并有助于快速的再折叠率，这可以增强蛋白质在面临不稳定的热暴露时恢复其活性的能力。鉴于在不同的蛋白质之间观察到的热稳定性范围广泛，有机会将不稳定的蛋白质设计为更加热稳定。这与植酸酶特别相关，植酸酶通常来自嗜温或较少的嗜热生物，并且通常很难在动物饲料造粒过程或工业过程中保持高水平的活性。在植物、微生物细胞或其他细胞生产系统中生产异源蛋白质的另一常见挑战是异源蛋白质作为人类过敏原(变应原)造成的风险。任何异源表达的酶对通过吸入或摄入而暴露于蛋白质的人表现出过敏原风险。为了降低蛋白质，特别是可能不经意地消耗的植物表达的蛋白质的过敏原风险，期望设计植酸酶，使其在暴露于胃环境、肠环境或暴露于胃蛋白酶时，具有降低的稳定性。如果含有工程化植酸酶的植物材料被无意中摄入，则胃蛋白酶稳定性降低使得蛋白质更安全，因为它容易在人体消化道中消化。
技术实现思路
在一方面中，本专利技术涉及工程化植酸酶。工程化植酸酶包括目标植酸酶(targetphytase)，第一结合元件和第二结合元件。第一结合元件与目标植酸酶融合，并且第二结合元件与目标植酸酶融合。第一结合元件与第二结合元件相互作用以引起工程化植酸酶的环化并且增强目标植酸酶的热稳定性。第一结合元件选自由以下各项组成的组中：内含肽或其部分，卷曲螺旋二聚化结构域或其部分，标签结构域(tagdomain)和捕捉结构域(catcherdomain)。第二结合元件选自由以下各项组成的组中：标签结构域、捕捉结构域、内含肽或其部分以及卷曲螺旋二聚化结构域或其部分。在一方面中，本专利技术涉及编码本文所述的任意一种工程化植酸酶的工程化核酸。在一方面中，本专利技术涉及编码工程化植酸酶的工程化核酸。工程化植酸酶包括目标植酸酶，第一结合元件和第二结合元件。第一结合元件和第二结合中的每一个与目标植酸酶融合。第一结合元件与第二结合元件相互作用以引起工程化植酸酶的环化，并增强目标植酸酶的热本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程化植酸酶，包括目标植酸酶、第一结合元件和第二结合元件，其中，所述第一结合元件和所述第二结合元件中的每个均与所述目标植酸酶融合，所述第一结合元件与所述第二结合元件相互作用以引起所述工程化植酸酶的环化，并且增强所述目标植酸酶的热稳定性，并且其中，所述第一结合元件或所述第二结合元件选自由以下各项组成的组中：标签结构域、捕捉结构域、内含肽或其部分和卷曲螺旋二聚化结构域或其部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.18 US 62/220,6881.一种工程化植酸酶，包括目标植酸酶、第一结合元件和第二结合元件，其中，所述第一结合元件和所述第二结合元件中的每个均与所述目标植酸酶融合，所述第一结合元件与所述第二结合元件相互作用以引起所述工程化植酸酶的环化，并且增强所述目标植酸酶的热稳定性，并且其中，所述第一结合元件或所述第二结合元件选自由以下各项组成的组中：标签结构域、捕捉结构域、内含肽或其部分和卷曲螺旋二聚化结构域或其部分。2.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，在所述相互作用时，所述第一结合元件和所述第二结合元件中的每个都能够自发地从所述工程化植酸酶释放出来。3.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第一结合元件或所述第二结合元件与所述目标植酸酶的N-末端或C-末端融合。4.根据权利要求3所述的工程化植酸酶，其中，所述第一结合元件的C末端连接至所述目标植酸酶的N末端，并与其邻接。5.根据权利要求3所述的工程化植酸酶，其中，所述第二结合元件的N末端连接至所述目标植酸酶的C末端，并与其邻接。6.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述目标植酸酶选自由以下各项组成的组中：来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、隔孢伏革菌(Peniophoralycii)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)和意大利拟牛链球菌(Schwaniomycesaccidentalis)的植酸酶。7.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述目标植酸酶包括与选自由SEQIDNO：53-54、56和219组成的组中的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第一结合元件是内含肽的C-内含肽。9.根据权利要求8所述的工程化植酸酶，其中，所述C-内含肽包括与选自由以下序列组成的组中的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、189、191和195。10.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第二结合元件是内含肽的N-内含肽。11.根据权利要求10所述的工程化植酸酶，其中，所述N-内含肽包括与选自由以下序列组成的组中的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、187和193。12.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第一结合元件是所述卷曲螺旋二聚化结构域的C-螺旋。13.根据权利要求12所述的工程化植酸酶，其中，所述C-螺旋包括与SEQIDNO：38或40的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第二结合元件是卷曲螺旋二聚化结构域的N-螺旋。15.根据权利要求14的工程化植酸酶，其中，所述N-螺旋包括与SEQIDNO：37或39的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。16.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第一结合元件是标签结构域。17.根据权利要求16所述的工程化植酸酶，其中，所述标签结构域包括与SEQIDNO：33或34的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。18.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述第二结合元件是捕捉结构域。19.根据权利要求18所述的工程化植酸酶，其中，所述捕捉结构域包括与SEQIDNO：35或36的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，还包括第一连接子，其中，所述第一连接子与所述第一结合元件和所述目标植酸酶邻接，并在它们之间。21.根据权利要求20所述的工程化植酸酶，其中，所述第一连接子包括与选自由以下序列组成的组中的序列具有至少90％同一性的序列：SEQIDNO：41、43、45、47、48、50和51。22.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，还包括第二连接子，其中，所述第二连接子与所述目标植酸酶和所述第二结合元件邻接，并在它们之间。23.根据权利要求22所述的工程化植酸酶，其中，所述第二连接子包括与选自由以下序列组成的组中的序列具有至少90％同一性的序列：SEQIDNO：42、44、46、49、50和51。24.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，包括与选自由以下序列组成的组中的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQIDNO：58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、201、203、205和207。25.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述植酸酶的活性在70℃至90℃范围的温度下是稳定的。26.根据权利要求1所述的工程化植酸酶，其中，所述工程化植酸酶包括在宿主中，其中，所述宿主选自由微生物、植物细胞、噬菌体、病毒、哺乳动物细胞和昆虫细胞组成的组中。27.一种编码权利要求1-26中任意一项所述的工程化植酸酶的工程化核酸。28.一种编码工程化植酸酶的工程化核酸，其中，所述工程化植酸酶包括目标植酸酶、第一结合元件和第二结合元件，其中，所述第一结合元件和所述第二结合元件中的每个均与所述目标植酸酶融合，所述第一结合元件与所述第二结合元件相互作用以引起所述工程化植酸酶的环化，并且增强所述目标植酸酶的热稳定性，并且其中，所述第一结合元件或所述第二结合元件选自由以下各项组成的组中：标签结构域、捕捉结构域、内含肽或其部分以及卷曲螺旋二聚化结构域或其部分。29.根据权利要求28所述的工程...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·拉布，G·拉扎尔，B·沈，
申请(专利权)人：谷万达公司，
类型：发明
国别省市：美国,US