葡聚糖酶的生产和使用其的方法技术

提供了用于在转基因植物中生产葡聚糖酶的方法和组成物，然后将转基因植物的部分引入动物饲料中。饲料中的葡聚糖酶显示出广泛pH范围内的活性和对温度的耐受性，这在动物饲料制备过程中经常会遇到。在转基因植物中生产该酶能够提高酶的热稳定性。

The method for the production and use of glucan enzyme

The methods and components for the production of glucan enzymes in transgenic plants were provided, and then the parts of the transgenic plants were introduced into animal feed. The glucan enzyme in the feed shows a wide range of activity in the pH range and the tolerance to temperature, which is often encountered during the preparation of animal feed. The production of this enzyme in transgenic plants can improve the thermal stability of the enzyme.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】葡聚糖酶的生产和使用其的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年5月14日提交的美国临时申请No.62/161.482的权利，并通过引用将其全部合并于此。与本申请一起电子提交标题为“序列表”的序列表创建于2016年5月14日，其大小为145921字节，通过引用将其全部合并于此。
本专利技术涉及表达具有提高热稳定性的葡聚糖酶的转基因植物、编码所述葡聚糖酶的核酸，和加工转基因植物与组织的方法，以及动物饲料的生产与利用方法。本专利技术还涉及饲料添加剂，以及含有所述葡聚糖酶的粮食和纤维加工助剂。
技术介绍
单胃和反刍动物的食物中非淀粉多糖的丰度(NSPs)会对饲料的营养价值产生不利影响，同时，如果它们能在饮食中被降解或者转化为有益的营养成分，则也提供了改善营养成分的机会。NSPs是植物细胞壁的主要结构成分(纤维素、半纤维素、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖等)，并且在某些植物中也可作为碳水化合物的存储储备。此外，果胶和树胶被认为是非细胞壁NSP。由于其多种多样的结构和生物学作用，NSPs常常约束或包围存在于以植物为基础的饲料原料(如谷物、豆类、青贮饲料等)和其他配料中的淀粉、蛋白质、脂肪和其他营养成分，抑制动物有效消化营养物质的能力。饮食中NSPs水平的增加会增加肠道内容物的粘度，这会干扰消化酶并降低营养物质的消化率，从而增加饲料转化率(饲料质量除以产肉质量)并减少体重增加量(Iji,P.A.1999.Theimpactsofcerealnon-starchpolysaccharidesonintestinaldevelopmentandfunctioninthebroilerchickens.WorldsPoult.Sci.J.55:375–387，通过引用将其全部并入本文)。例如，肉鸡饲料中增加瓜尔豆粉胚芽部分(0％、5％或7.5％)或瓜尔豆粉谷壳部分(0％、2.5％或5％)的水平导致食糜粘度增加(Lee,J.T.,C.A.Bailey,andA.L.Cartwright.2003.β-Mannanaseamelioratesviscosity-associateddepressionofgrowthinbroilerchickensfedguargermandhullfractions.Poult.Sci.82:1925-1931，通过引用将其全部并入本文)。除了增加粘度外，随着瓜尔豆粉谷壳部分的增加，体重增加量和饲料转化率也更低，表明高粘度对动物生产性能的负面影响。也已知，NSPs不经意地会触发肠道免疫反应，这会进一步降低饲料利用率，并对动物健康产生影响。除了谷物成分，现在的饮食也通常含有DDGS(干酒糟及可溶物)，这也不易消化。多项研究表明，补充酶能够提高饮食代谢能(ME)和/或降低含有高水平小麦、大麦、DDGS或其他纤维成分的饮食粘度。当配方降低3％的饮食代谢能时，在玉米豆粉型肉鸡饮食中添加糖酶已经完成，而不影响在寒暑季节饲养的肉鸡的饲料转化率。已经确定的是，水解的β-D-葡聚糖是改善生长的原因。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及在样本中识别玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法。该方法包括将样本与第一引物和第二引物接触。该方法包括扩增样本中的核酸以获得扩增产物。该方法还包括检测述扩增产物，所述扩增产物对玉米事件4588.259、4588.757或4588.652中靶序列是特异性的。一方面，本专利技术涉及含有转基因植物或其部分的动物饲料。该转基因植物或其部分含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQIDNOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。一方面，本专利技术涉及生产动物饲料的方法。该方法包括将转基因植物或其部分与植物材料混合以形成混合物。该转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQIDNOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。一方面，本专利技术涉及提高饮食代谢能的方法。该方法包括将转基因植物或其部分与饲料成分混合。所述转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQIDNOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。一方面，本专利技术涉及提高谷物中可发酵糖产出(production)的方法。该方法包括将来自本文描述的所述转基因植物中任意一种的谷物与来自其他植物的谷物混合，以形成混合谷物。该方法还包括将混合谷物加工成可发酵糖。所述可发酵糖随后转化为乙醇或类似的发酵产物，其中可以包括丁醇、乳酸、柠檬酸、醋酸或其他燃料或化学品。一方面，本专利技术涉及包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物、转基因谷物或转基因生物质。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQIDNOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。一方面，本专利技术涉及人工合成的多肽或其片段。该人工合的成多肽或其片段包括的氨基酸序列与选自由SEQIDNOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性。该葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。附图说明结合附图阅读将更好地理解本专利技术优选实施方式的以下详细描述。为了说明本专利技术，附图中显示出了具体实施方式。然而，应当理解，本专利技术不限于展示的精确安排和手段。在附图中：图1表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4258。图2表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4588。图3表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4597。图4表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4708。图5表明携带两个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4766。图6表明携带两个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4767。图7表明携带三个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4770。图8表明携带三个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4771。图9为表明从携带pAG4588构建体的玉米植株的谷穗中获得的葡聚糖酶活性范围的图表。图10为表明从携带pAG4597构建体的玉米植株的谷穗中获得的葡聚糖酶活性范围的图表。图11为显示玉米事件4588.652第7号染色体上的T-DNA整合位点的图表。图12为表明在T1代植株中观察到的葡聚糖酶活性的图表。图13为表明半合子、纯合子和杂交植株的种子中的葡聚糖酶活性的图表。图14表明了实时PCR试验的总体设计，用于确定转基因事件中T-DNA位点(标准和实时PCR)和接合性(仅实时PCR)的存在。带箭头的字母A、B、X和Y指示引物结合位点。矩形框A+B和X+Y代表从各自引物对扩增的PCR产物。图15表明了标准PCR检测的总体设计，用于确定转基因事件中T-DNA位点和接合性(zygosity)的存在。带箭头的字母A、B和C指示引物结合位点。矩形框A+B和A+C代表从各自引物对扩增的PCR产物。图16表明自交分离(selfedsegregating)4588.652植株的标准多重PCR分析。图17为表明用于确定玉米事件4588.259(FG259)中T-DNA位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种识别样本中玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法，该方法包括：将样本与第一引物和第二引物接触；扩增样本中的核酸，以获得扩增产物；并且检测玉米事件4588.259、4588.757或4588.652中特异于靶序列的扩增产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.14 US 62/161,4821.一种识别样本中玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法，该方法包括：将样本与第一引物和第二引物接触；扩增样本中的核酸，以获得扩增产物；并且检测玉米事件4588.259、4588.757或4588.652中特异于靶序列的扩增产物。2.根据权利要求2所述的方法，其中，所述核酸包括选自由SEQIDNOS:51-55所组成的组中的序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一引物包括选自由SEQIDNOS:38、41和47所组成的组中的核酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二引物包括选自包由SEQIDNOS:39、42、43、45和46所组成的组中的核酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶序列为选自由SEQIDNOS:22-31所组成的组中的序列中的至少一种。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测步骤包括，在高严格度条件下将扩增产物与包括SEQIDNOS:40的序列的核酸杂交，并选择特异于玉米事件4588.259的扩增产物。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测步骤包括，在高严格度条件下将扩增产物与包括SEQIDNOS:44的序列的核酸杂交，并选择特异于玉米事件4588.652的扩增产物。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本包括来自含有一种或多种编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物的植物材料，其中，所述葡聚糖酶包括与SEQIDNO:4的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并能够降解一种或多种多糖。9.一种动物饲料，该动物饲料包括含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物或其部分，其中，该葡聚糖酶包括与选自由SEQIDNOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并能够降解一种或多种多糖。10.根据权利要求9所述的动物饲料，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。11.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，所述人工合成的核酸包括与选自由SEQIDNOS:1-3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列。12.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于5.0到10.0的pH范围内时具有活性。13.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于25℃到130℃的温度范围内时具有活性。14.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，在植物中表达的葡聚糖酶的活性与在细菌细胞中表达的具有相同氨基酸序列的葡聚糖酶的活性相比稳定性提高。15.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，所述转基因植物选自由小麦、玉米、大麦和高粱所组成的组中。16.根据权利要求10所述的动物饲料，其中，所述动物饲料进一步包括饲料补充剂。17.根据权利要求16所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂为植物材料。18.根据权利要求17所述的动物饲料，其中，所述植物材料为非转基因植物或工程植物。19.根据权利要求16所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括一种或多种外源酶。20.根据权利要求19所述的动物饲料，其中，所述一种或多种外源酶包括选自由木聚糖酶、内源葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶和甘露聚糖酶所组成的组中的水解酶。21.根据权利要求17所述的动物饲料，其中，所述植物材料包括至少一种选自由玉米粉、玉米粒、小麦粉、小麦粒、小麦谷粒、大麦谷粒、大麦粒、大豆粉、大豆饼、高粱谷粒和高粱粒所组成的组中的成分。22.根据权利要求16所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括至少一种选自由可溶性固形物、脂肪和蛭石、石灰岩、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌素、维生素预混剂、磷酸氢二钙、硒预混剂、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混剂所组成的组中的成分。23.一种生产动物饲料的方法，该方法包括将转基因植物或其部分与植物材料混合以形成混合物，其中，所述转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，所述葡聚糖酶包括与选自由SEQIDNOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并能够降解一种或多种多糖。24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述人工合成的核酸包括与与选自由SEQIDNOS:1-3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列。26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于5.0到10.0的pH范围内时具有活性。27.根据权利要求23所述的方法，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于25℃到130℃的温度范围内时具有活性。28.根据权利要求23所述的方法，其中，在植物中表达的葡聚糖酶的活性与在细菌细胞中表达的具有相同氨基酸序列的葡聚糖酶的活性相比稳定性提高。29.根据权利要求23所述的方法，其中，所述转基因植物选自由小麦、玉米、大麦和高粱所组成的组中。30.根据权利要求23所述的方法，该方法进一步包括将混合物制粒。31.根据权利要求30所述的方法，该方法进一步包括向混合物中添加饲料补充剂。32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述饲料补充剂包括至少一种外源酶。33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述至少一种外源酶是选自由木聚糖酶、甘露聚糖酶,蛋白酶、植酸酶和纤维素酶所组成的组中的水解酶。34.一种提高饮食代谢能的方法，该方法包括将转基因植物或其部分与饲料成分混合，其中，所述转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，所述葡聚糖酶包括与选自由SEQIDNOS:4-6所组成的组中的参...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·莱布，O·布格瑞，X·李，
申请(专利权)人：谷万达公司，
类型：发明
国别省市：美国,US