一种抗HER2多肽-阿霉素复合物及其制备方法和应用技术

一种抗HER2多肽‑阿霉素复合物及其制备方法和应用，结构式如下所示：

An anti HER2 polypeptide adriamycin complex and preparation method and application thereof

The invention relates to an anti HER2 polypeptide adriamycin complex and a preparation method and application thereof.

【技术实现步骤摘要】
一种抗HER2多肽-阿霉素复合物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物与医药
，具体涉及一种具有治疗HER2阳性乳腺癌作用的抗HER2多肽-阿霉素复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
有研究发现在20％到30％的乳腺癌患者中存在HER2过表达的现象，人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)作为人表皮生长因子受体家族成员，它的过表达与肿瘤更快的恶性生长、不良预后和总体生存率的降低都息息相关。与人表皮生长因子受体家族其他成员一样，HER2具有三个域：胞外配体结合域、跨膜域、胞内酪氨酸激酶域。这三个域对受体二聚化和下游信号通路的激活都至关重要，下游信号通路的激活可能导致肿瘤细胞的增殖与存活(如PI3K/AKT信号通路)，最终会增加乳腺癌的风险。目前，曲妥珠单抗(赫赛汀)是治疗HER2阳性乳腺癌最为重要的药物之一。这种人源化单克隆抗体可以结合HER2的胞外部分从而阻止HER2的二聚化进而抑制HER2介导的恶性转化。曲妥珠单抗可能是通过下调HER2表达和加快HER2的翻转从而降低HER2信号来达到治疗作用。与此同时，有研究证据表明曲妥珠单抗与化疗药物例如阿霉素(DOX)联用可以获得更好的治疗效果。众所周知，阿霉素通过简单扩散进入细胞后插入到DNA结构中从而抑制拓扑异构酶II进而阻止DNA的复制。曲妥珠单抗与阿霉素的联合应用尽管取得了一定的临床治疗效果，但因其缺乏选择性和由曲妥珠单抗和阿霉素蓄积导致的严重心脏毒性使得这样简单的药物联用通常并不推荐使用。在这一背景下，曲妥珠单抗-阿霉素复合物被成功研制出来并证明复合物通过曲妥珠单抗对HER2的特异性识别可以提高药物的选择性、降低药物的心脏毒性。与大多数抗体药物复合物一样，由于“结合位点屏障”作用曲妥珠单抗-阿霉素复合物也缺乏很好的肿瘤穿透性。相比于抗体，多肽具有分子量低、突出的组织/细胞穿透性、易于合成、便于化学修饰和免疫原性低等优点。有研究以曲妥珠单抗的补体决定域重链3(complementarity-determiningregionheavychain3,CDR-H3)的环状结构为基础设计了具有12个氨基酸的抗HER2环肽(exocyclicanti-HER2/neupeptidemimic,AHNP)，这一环肽能很好地与HER2胞外域相结合。与此同时，有研究发现AHNP与曲妥珠单抗具有相似的药物作用效果。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种抗HER2多肽-阿霉素复合物及其制备方法和应用，该复合物具有治疗HER2阳性乳腺癌的作用。技术方案：一种抗HER2多肽-阿霉素复合物，结构式如式I所示：抗HER2多肽-阿霉素复合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1，将阿霉素溶于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下避光室温搅拌10分钟；加入芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)后滴加N,N’-二异丙基乙胺(DIPEA)，阿霉素与DIPEA的摩尔比为1:8，避光室温搅拌4小时，阿霉素与Fmoc-Cl摩尔比为1:2；步骤2，使用真空冷冻浓缩仪除去溶剂直至剩余油状液体后加入0.1％三氟乙酸(TFA)后离心收集沉淀，以除去未反应的阿霉素，再将沉淀用乙醚洗两次离心收集沉淀以除去未反应的Fmoc-Cl，制得N-Fmoc-DOX；步骤3，将N-Fmoc-DOX和戊二酸酐溶于DMF后滴加DIPEA，N-Fmoc-DOX与戊二酸酐摩尔比为1:8，N-Fmoc-DOX与DIPEA的摩尔比为1:8，在氮气保护下避光室温搅拌16小时；通过制备型高效液相色谱对粗产物进行分离纯化得到N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate；步骤4，在氮气保护下将N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和DIPEA溶于DMF反应15分钟来活化N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate上的羧基，N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate与DIPEA的摩尔比为1:8，N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate与2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的摩尔比为2:3；将多肽GPLGLAGDDYCDGFYACYMDV-NH2(MAHNP,disulfide-bridged)溶于DMF，将多肽溶液加入到N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate溶液中，避光室温搅拌过夜，N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate与多肽摩尔比为1:1；步骤5，使用真空冷冻浓缩仪除去溶剂直至剩余油状液体，加入乙酸乙酯离心收集沉淀以除去未反应的N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate；步骤6，将沉淀溶于溶剂搅拌30分钟以脱去保护基团Fmoc，所述溶剂为哌啶和DMF的混合物，哌啶和DMF的体积比为1:9；滴加TFA与DMF的混合物直至溶液颜色变为淡红色以终止反应，TFA和DMF的体积比为1:9；使用真空冷冻浓缩仪除去溶剂，通过制备型高效液相色谱进行纯化得到精制品MAHNP-DOX。上述制备型高效液相色谱使用WatersXBridgeC18色谱柱在室温下进行色谱分离，色谱柱具体参数为19mm×150mm,5μm；流动相A为0.01％甲酸-水溶液，流动相B为100％乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：0～15min，30％～98％流动相B；15～18min，98％～30％流动相B；18～20min，30％～30％流动相B。上述抗HER2多肽-阿霉素复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。治疗HER2阳性乳腺癌的药物，有效成分为式I所示的抗HER2多肽-阿霉素复合物。上述抗HER2多肽-阿霉素复合物在制备治疗HER2阳性乳腺癌制剂中的应用。有益效果：1)本专利技术所述的MAHNP为多肽，可化学合成，稳定性好；2)本专利技术所述的MAHNP-DOX在肿瘤微环境中，多肽MAHNP被MMP-2剪切，释放出药理活性的阿霉素和抗HER2多肽AHNP；3)本专利技术的抗HER2多肽-阿霉素复合物通过各部分结合，达到一个综合性的效果，相比单一药物具有更高肿瘤生长抑制特征，以HER2高表达的人乳腺癌细胞BT474和SKBR3为细胞模型，以荷瘤小鼠为动物模型，MAHNP-DOX可在肿瘤微环境中通过MMP-2的剪切作用在细胞外释放出药理活性的阿霉素和抗HER2多肽AHNP，多肽AHNP降低AKT表达活性，阿霉素与多肽AHNP协同作用抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡，将肿瘤细胞阻滞于G1期，抑制裸鼠移植肿瘤的生长；4)本专利技术的多靶点多肽-阿霉素复合物整体效果能综合各组成部分(如DOX，MAHNP等)的作用，并且各组成部分之间不会相互影响，能够使得各组成部分发挥最佳效果。附图说明图1为本专利技术的MAHNP-DOX复合物的合成流程示意图；图2为本专利技术的MAHNP-DOX的LC/MS/MS图谱；其中，A：MAHNP-DOX的母离子图；B：MAHNP-DOX的子离子图；图3为本专利技术的MAHNP-DOX及游离DOX对BT474和SKBR3细胞生长抑制曲线；图4为BT474和SKBR3细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗HER2多肽‑阿霉素复合物，其特征在于结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种抗HER2多肽-阿霉素复合物，其特征在于结构式如式I所示：2.权利要求1所述抗HER2多肽-阿霉素复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，将阿霉素溶于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下避光室温搅拌10分钟；加入芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)后滴加N,N’-二异丙基乙胺(DIPEA)，阿霉素与DIPEA的摩尔比为1:8，避光室温搅拌4小时，阿霉素与Fmoc-Cl摩尔比为1:2；步骤2，使用真空冷冻浓缩仪除去溶剂直至剩余油状液体后加入0.1％三氟乙酸(TFA)后离心收集沉淀，以除去未反应的阿霉素，再将沉淀用乙醚洗两次离心收集沉淀以除去未反应的Fmoc-Cl，制得N-Fmoc-DOX；步骤3，将N-Fmoc-DOX和戊二酸酐溶于DMF后滴加DIPEA，N-Fmoc-DOX与戊二酸酐摩尔比为1:8，N-Fmoc-DOX与DIPEA的摩尔比为1:8，在氮气保护下避光室温搅拌16小时；通过制备型高效液相色谱对粗产物进行分离纯化得到N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate；步骤4，在氮气保护下将N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和DIPEA溶于DMF反应15分钟来活化N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate上的羧基，N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate与DIPEA的摩尔比为1:8，N-Fmoc-DOX-14-O-hemiglutarate与2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的摩尔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芸，尤一雯，许志远，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32