本发明专利技术公开了一种MSTN基因分子育种标记，其是MSTN基因的第三外显子序列上的三个单核苷酸变异位点，以起始密码子为起点，分别为C714T、G729A、和G753T。本发明专利技术是根据分子标记辅助育种的理论技术要求，在中华绒螯蟹群体中筛选出与生长性状（如体重）紧密关联的MSTN基因的育种标记，并在中华绒螯蟹的育种群体中筛选和构建带有MSTN育种分子标记的中华绒螯蟹选育群体。为开展中华绒螯蟹的分子标记辅助育种奠定基础和提供参考。
Construction method of breeding population of Eriocheir sinensis with molecular marker of MSTN gene
The present invention discloses a molecular breeding marker for MSTN gene, which is the three single nucleotide variation loci on the third exon sequence of the MSTN gene, starting with the starting codon, C714T, G729A, and G753T, respectively. The invention is based on the theoretical and technical requirements of molecular marker assisted breeding. The breeding markers of MSTN gene closely related to growth traits (such as weight) are screened in the Chinese Eriocheir crab population, and the breeding population of Eriocheir sinensis with MSTN breeding molecular markers is screened and constructed in the breeding population of Eriocheir sinensis. It will lay a foundation and provide reference for developing molecular marker assisted breeding of Eriocheir sinensis.
【技术实现步骤摘要】
一种带有MSTN基因分子育种标记的中华绒螯蟹选育群体构建方法
本专利技术涉及构建带有与中华绒螯蟹生长密切相关的MSTN基因分子育种标记的河蟹选育群体的方法。
技术介绍
分子标记辅助育种（MarkerAssistedSelection，MAS）是利用分子标记与决定目标性状的基因紧密连锁的特点，在动植物育种过程中筛选与重要的经济性状（如体重、生长速度、抗逆性等）相关的分子标记，并在育种过程中构建带有相关分子标记的选育群体，以达到选择目标性状的目的的一种育种方法。分子标记辅助育种具有目标性强，准确性高的特点，能够大幅度提高育种效率，缩短育种年限。该方法已在动植物育种过程中广泛应用，通过标记辅助选择育成了一批有价值的种质，取得了良好的选育效果。单核苷酸位点多态性（SingleNucleotidePolymorphisms,SNP）是基因组上由单个核苷酸产生的碱基变异，其具有分布数量多、多态性丰富等特点，是继微卫星分子标记之后又一重要的分子遗传标记，被称为第三代分子遗传标记。该标记已广泛应用于动植物标记辅助育种、基因定位、遗传多样性研究等领域。肌肉生长抑制素基因（Myostatin，MSTN），又称生长分化因子8，是生物体内广泛表达的一种糖蛋白，对肌肉生长发育起着负向调控的作用。据报道该基因的多态性与许多动物的生长性状和肉质性状等存在显著的关联。在育种上，MSTN基因已应用于肉用动物品种选育，使选育动物躯体增大，肌肉率大大提高，对畜牧业产生了重大影响。中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis),俗称河蟹，是我国极为重要的水产经济动物。2016年全国成蟹产量超80万吨，年养殖产值超400亿元。中华绒螯蟹虽然是我国重要的水产经济动物，但目前我国的河蟹产业面临着种质混杂、种质退化、良种少、良种覆盖率低等一系列制约着河蟹产业发展的瓶颈问题。截至目前，虽然我国已选育出经全国水产原种和良种审定委员会审定通过的5个中华绒螯蟹良种（长江1号、光合1号、长江2号、江海21、诺亚1号），但中华绒螯蟹的良种数量远不能满足其庞大的产业规模和巨大的苗种需求。在另一方面，这些中华绒螯蟹均采用传统育种方法一代一代选育而成，育种时间长，育种效果缓慢，无法及时提供生产上对良种的快速需求。因而，当前对中华绒螯蟹的良种需求仍非常强烈，开展中华绒螯蟹分子标记辅助育种工作不仅十分必要和迫切，而且对我国现代渔业的发展和培育具有优质特性的河蟹新品种具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与河蟹生长性状密切相关的MSTN基因的SNP分子育种标记，并提供构建带有MSTN育种标记的河蟹选育群体的方法。通过该方法获得的河蟹选育群体全部带有纯和的MSTN育种标记的基因型，将具有明显的生长优势，为河蟹的新品种选育提供优异种质。本专利技术提供的技术方案是：一种MSTN基因分子育种标记，其是MSTN基因的第三外显子序列上的三个单核苷酸变异位点，以起始密码子为起点，分别为C714T、G729A、和G753T。所述的分子育种标记，优选地，其是C714T。同时，本专利技术还提供一种中华绒螯蟹分子育种标记筛选亲本的方法，该方法筛选保留MSTN基因第714位点为TT基因型的个体。所述的方法，优选地，所保留的个体的体重要求雄性>200g，雌>150g；所述筛选是通过PCR扩增和测序实现的；所述PCR扩增是针对第三外显子序列的扩增设计的引物进行扩增的。上述的方法，所述PCR扩增的引物序列如下：MSTN-F:5'-CAGCGTGAAATGCGAAAG-3'，MSTN-R:5-'GCATCTTCATAGGCGACAAC-3'。本专利技术提供一种带有MSTN基因分子育种标记的中华绒螯蟹选育群体构建方法，具体包括如下步骤：（1）MSTN基因SNPs多态性的鉴别：根据河蟹MSTN基因的序列（Genbank号：EU650662.1）设计特异引物，在10个河蟹个体中进行PCR扩增，通过测序获得MSTN基因的3个SNP位点（SNP1，SNP2和SNP3）共9种基因型（TT/TC/CC，AA/AG/GG，TT/TG/GG）；（2）MSTN基因SNPs的多态性与河蟹生长性状的关联分析：分别在河蟹3个不同的群体（育种群体、大赛群体、野生群体）中的317个个体进行MSTN基因的扩增，获得每个个体MSTN基因的基因型，并利用统计学软件，将9个基因型与河蟹的生长性状进行关联分析；（3）MSTN基因分子育种标记的确认：根据基因型与生长性状的关联分析结果，在3个河蟹群体中筛选与河蟹生长最为密切相关的基因型作为育种标记；（4）筛选带有MSTN育种标记的个体构建选育群体：在2016年河蟹育种群体中，筛选具有MSTN育种标记基因型的河蟹亲本，要求每个选择的亲本个体都必须带有MSTN育种标记，且雌蟹体重大于150g，雄蟹体重大于200g；（5）带有MSTN育种标记的河蟹亲本的繁育：将挑选的带有MSTN分子育种标记的河蟹亲本暂养于亲本培育池进行强化培育，然后根据雌雄1.5-2：1的比例进行配组交配和土池生态育苗，获得带有MSTN分子育种标记的河蟹群体。上述第（2）步中，进行基因型与生长性状的关联分析时，必须在多个不同的群体中进行验证，不能只在一个群体中进行分析。上述第（3）步中，MSTN基因育种标记基因型的确认，必须保证在所验证的多个群体中该基因型均为与河蟹生长最密切的基因型。上述第（4）步中，挑选的河蟹繁育亲本必须带有MSTN基因育种标记的基因型（SNP1TT型），且要保证雌蟹体重大于150g，雄蟹体重大于200g。本专利技术的具有如下优点：本专利技术是根据分子标记辅助育种的理论技术要求，在中华绒螯蟹群体中筛选出与生长性状（如体重）紧密关联的MSTN基因的育种标记，本专利技术所构建的河蟹选育群体的所有个体均带有MSTN基因的育种标记（SNP1：TT基因型），关联分析的结果表明有MSTN育种标记（SNP1：TT基因型）的个体比其他基因型个体的生长优势更加突出。因此，通过本专利技术所构建的河蟹选育群体将具有明显的生长优势，为河蟹的进一步的良种选育工作奠定基础。附图说明图1为MSTN基因的3个SNP位点和9个基因型组合情况。具体实施方式本专利技术的具体实施方式如下：1.MSTN基因SNPs多态性位点的鉴别根据NCBI下载的中华绒螯蟹MSTN基因的全长序列（GeneBankNo:EU650662.1）设计引物，在10个河蟹样本的cDNA中扩增MSTN基因的序列，经生物公司测序后发现，MSTN基因的第三外显子序列上存在3个单核苷酸变异（SNPs）位点，分别为（C714T、G729A、G753T，以起始密码子为起点）（图1），分别命名为SNP1，SNP2和SNP3。2.基因SNPs标记在大群体中的生长关联分析为了评估MSTN基因3个SNP位点9个基因型与河蟹生长性状的相关性，选取了3个不同的河蟹群体，1）育种群体，河蟹配套选育系A、B及其正反杂交子一代，数量120只；2）河蟹大赛参赛群体，包括2010年，2012年及2014年度全国河蟹大赛的参赛样本，数量120只；3）野生群体，来自于长江、黄河等水系的野生群体，数量77只。以上所采集的河蟹样本均为完成生殖蜕壳的性成熟河蟹。首先，利用电子天平完成每只蟹的体重称量（精本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种MSTN基因分子育种标记，其特征在于，其是MSTN基因的第三外显子序列上的三个单核苷酸变异位点，以起始密码子为起点，分别为C714T、G729A、和G753T。
【技术特征摘要】
1.一种MSTN基因分子育种标记，其特征在于，其是MSTN基因的第三外显子序列上的三个单核苷酸变异位点，以起始密码子为起点，分别为C714T、G729A、和G753T。2.如权利要求1所述的分子育种标记，其特征在于，其是C714T。3.一种中华绒螯蟹分子育种标记筛选亲本的方法，其特征在于，筛选保留MSTN基因第714位点为TT基因型的个体。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所保留的个体的体重要求雄性&...
【专利技术属性】
技术研发人员：王军，陈义培，吴廉，王成辉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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