一种脲基甲酸水解酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种脲基甲酸水解酶及其制备方法。包括以下步骤：1)利用PCR技术扩增得到脲基甲酸水解酶的克隆，2)构建脲基甲酸水解酶的表达载体；3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，进一步诱导表达、和纯化蛋白得到脲基甲酸水解酶。该方法简单，易操作，且发现了新的基因序列的脲基甲酸水解酶，该酶在低温条件下依然具备较强的酶学活性。另外，本发明专利技术还提供该脲基甲酸水解酶的多克隆抗体以及其检测方法，对低温菌Cryobacterium属菌种的鉴定提供新的依据，对于脲基甲酸水解酶的研究提供了新的研究方向。

A urea - carboxylic acid hydrolase and its preparation method

The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a urea formic hydrolase and a preparation method thereof. The following steps were included: 1) the cloning of urea based formic acid hydrolase was amplified by PCR technology. 2) the expression vector of urea based formic acid hydrolase was constructed; 3) the expression vector was transformed into the Escherichia coli to get the recombinant strain, and the expression and purified protein were further induced and purified to the ureic acid hydrolase. The method is simple and easy to operate, and a new gene sequence of urea formic hydrolase is found. The enzyme still has strong enzymatic activity at low temperature. In addition, the invention also provides the polyclonal antibody and its detection method for the ureic acid hydrolase, and provides a new basis for the identification of the strains of the Cryobacterium genus, and provides a new direction for the research of UU hydrolase.

【技术实现步骤摘要】
一种脲基甲酸水解酶及其制备方法
本专利技术属于分子生物学领域，主要涉及一种脲基甲酸水解酶及其应用。
技术介绍
脲基甲酸水解酶，英文名：Allophanatehydrolase。脲基甲酸水解酶在三嗪类除草剂的降解过程中起重要作用，它催化降解脲基甲酸，生成氨气和二氧化碳。对于如阿拉特津除草剂等含有三嗪的污染物具有降解作用，在环境保护领域具有广阔的应用前景。利用脲基甲酸水解酶降解除草剂污染物的中间体脲基甲酸具有极大的应用前景，在低温条件条件下，以脲基甲酸为底物降解生成氨气，净化环境具有较好的效果。目前生产得到的脲基甲酸水解酶对低温的耐受能力差，在低温下几乎不能发挥活性，在工业生产上，对温度的要求较高。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的是提供一种低温适应性好的脲基甲酸水解酶，并相应开发一种更高效、简便的制备脲基甲酸水解酶的方法。本专利技术提供一种脲基甲酸水解酶的氨基酸序列，所述脲基甲酸水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供一种脲基甲酸水解酶基因的核苷酸序列，所述脲基甲酸水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。相应地，本专利技术提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重组载体、重组菌株以及表达上述脲基甲酸水解酶的方法。本专利技术提供包含上述脲基甲酸水解酶基因的重组载体，优选为pET21a；本专利技术提供包含上述脲基甲酸水解酶基因PCR扩增的引物序列，正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4；将本专利技术的脲基甲酸水解酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，作为本专利技术的一个优选的实施方案，具体的是将本专利技术的脲基甲酸水解酶基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-APH；本专利技术还提供了一种表达上述脲基甲酸水解酶的方法，包括以下步骤：1)将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的脲基甲酸水解酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-APH；2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株EcoliBL21-pET21a-APH；3)将EcoliBL21-pET21a-APH扩大培养，诱导表达脲基甲酸水解酶，收集菌体；4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的脲基甲酸水解酶。相应地，本专利技术提供上述脲基甲酸水解酶鼠来源的多克隆抗体的制备和检测方法，包括以下步骤：1)纯化后的脲基甲酸水解酶注射小鼠，采集血清；2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；4)将步骤3)中纯化得到的抗体与脲基甲酸水解酶的原始菌株的破碎液进行WesternBlotting检测。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术通过PCR技术在喜冷杆菌属中扩增得到脲基甲酸水解酶基因，并且通过NCBIBlast碱基序列比对证明该脲基甲酸水解酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的脲基甲酸水解酶基因序列；2)通过基因工程技术得到表达脲基甲酸水解酶蛋白的EcoliBL21-pET21a-APH重组菌株，诱导表达重组菌株得到脲基甲酸水解酶蛋白；3)利用EcoliBL21-pET21a-APH重组菌株诱导表达脲基甲酸水解酶蛋白的方法简单，易操作，而且发现了新的脲基甲酸水解酶基因序列，该脲基甲酸水解酶在低温条件下依然具备较强的酶学活性；4)本专利技术提供了制备和检测该蛋白的多克隆抗体，为进一步开展脲基甲酸水解酶功能分析奠定基础，并为Cryobacterium属的菌种中的鉴定提供证据及低温适应机制的研究提供新的方向。附图说明图1为PCR扩增脲基甲酸水解酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNAmarker，1号泳道为PCR扩增脲基甲酸水解酶基因的产物；图2为表达载体pET21a-APH的构建示意图；图3为重组菌株EcoliBL21-pET21a-APH表达脲基甲酸水解酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为proteinmarker；1号泳道为脲基甲酸水解酶蛋白；图4为细菌脲基甲酸水解酶多克隆抗体的WesternBlotting分析图。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述，但不限制本专利技术。凡是不背离本专利技术构思的改变或等同替代均包括在本专利技术的保护范围之内。本具体实施方式仅为最佳例举，并非对本专利技术技术方案的限制性实施。实施例1脲基甲酸水解酶基因的获取1)获取含有目的基因的菌株本专利技术利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如专利号为201710034491.5的中国专利技术专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016604。保藏日期为2016年10月31日，保藏地址为，中国武汉，武汉大学。2)基因组的提取利用DNA提取试剂盒(TAKARADalian)提取Cryobacteriumbaishanse02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。3)PCR扩增目的基因设计引物：正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：表1成分体积10×PCR缓冲液5μl引物F1μl引物R1μl模板80ngMgSO42μldNTP5μl去离子水35μl总计50μlPCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸2.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的1926bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。测序结果如SEQIDNO.2所示，将SEQIDNO.2所示的碱基序列在NCBIBlast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与CryobacteriumarcticumstrainPAMC27867的脲基甲酸水解酶相似性为91％，即可判断SEQIDNO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的脲基甲酸水解酶序列。实施例2构建脲基甲酸水解酶的表达载体将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和NdeI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶HighLigation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到脲基甲酸水解酶的表达载体pET21a-APH，表达载体pET21a-APH的构建如图2所示。实施例3表达和纯化细菌脲基甲酸水解酶将实施例2得到的表达载体pET21a-APH转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大肠杆菌BL21的感受态的制备采用CaCl2法，CaCl2法制备大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脲基甲酸水解酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种脲基甲酸水解酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种脲基甲酸水解酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的脲基甲酸水解酶。3.如权利要求2所述的脲基甲酸水解酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2或3所述脲基甲酸水解酶基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述载体的构建方法为：将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的脲基甲酸水解酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-APH。6.包含权利要求2或3所述脲基甲酸水解酶基因PCR扩增的引物序列。7.根据权利要求6所述的引物序列，其特征在于：所述引物序列的正向引物如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4。8.一种制备权利要求1所述的脲基甲酸水解酶的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫春杰，薛栋升，陶冶，胡征，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42