一种重组人透明质酸及其生产方法技术

本发明专利技术提供一种与人体同源的重组人透明质酸，该重组人透明质酸结构式如下：

A recombinant human hyaluronic acid and its production method

The invention provides a recombinant human hyaluronic acid homologous to the human body.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人透明质酸及其生产方法
本专利技术涉及日用化工领域，特别涉及一种重组人透明质酸及其生产方法。
技术介绍
透明质酸，又名玻璃酸，是一种高分子的聚合物，由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级酸性粘多糖，它是肌肤水嫩的重要基础物质，本身也是人体的一种成分，它具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，它还可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。现有的透明质酸的来源中，动物提取的方法由于原料有限，且原料中透明质酸含量低，导致收率低、提纯难、成本高、产品质量较差，难以规模化生产；生物发酵提取的方法优点是产量大、成本低，占据全球市场的70％，但采用的工艺发酵周期往往较长、产品蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低、产品透光率差，有的甚至是呈现纤维状的形态，不易溶解，同时得到的透明质酸分子量较大，一般在80-120万之间，主要功能是保水保湿和形成组织保护膜及填充物，并不能被人体皮肤吸收；目前以大分子透明质酸为原料，采用机械、化学、酶等不同处理方式，制造低分子透明质酸的方法由于克服了以上缺点而被广泛接受，特点是比大分子透明质酸容易吸收，吸收后可以产生透明质酸的功能作用，如锁水保湿、优化代谢环境、促进创口愈合等，但这类方法得到透明质酸不仅产量低而且几乎没有人体活性，所以并不能在对人体的应用中起到实质性的活性功效作用。据了解透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，它可以通过催化透明质酸的水解来降低透明质酸的长度、分子量以及黏度，可以快速生产出满足不同需求的透明质酸片段。根据作用机理与降解产物的不同，可将一般的透明质酸酶分为三类，第一类包括β-D-乙酰-D-己糖胺酶，将高分子量底物如透明质酸、软骨素或硫酸软骨素A和C降解成四糖D-葡萄糖醛酸-N-乙酰葡糖胺-D-葡萄糖醛酸-N-乙酰葡糖胺作为主要的终产物，如睾丸透明质酸酶能够催化转糖基作用，因此在水解透明质酸的过程中也会形成六碳糖、二糖以及八碳糖；第二类，以水蛭透明质酸酶为代表的透明质酸酶，将高分子量底物透明质酸降解成四糖N-乙酰葡糖胺-D-葡萄糖醛酸-N-乙酰葡糖胺-D-葡萄糖醛酸作为主要的终产物；第三类，细菌透明质酸酶，它是一种裂解酶，将高分子量底物透明质酸或软骨素降解成不饱和的N-乙酰葡糖胺-D-葡萄糖醛酸多糖结构作为主要的终产物。研究发现使用一般的透明质酸酶降解大分子透明质酸得到小分子透明质酸片段的方法因存在酶的同源性、酶的半衰期、原料来源及酶解工艺等影响产物产量和产物人体活性的问题，而亟待进一步优化和解决，所以寻找一种更加行之有效的可以制备具有人体活性的小分子透明质酸的方法迫在眉睫。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术是这样实现的：本方法采用转基因技术优化处理后得到的与人体同源的重组人透明质酸酶取代一般的透明质酸酶对选取的大分子量透明质酸进行酶切，得到同源性酶切末端，并对酶切工艺进行优化和调控，得到大量包含3-10个双糖单位、分子量在1000-4000D的透明质酸寡糖片段，这些特异性小分子量的包含同源性酶切末端的透明质酸片段即为重组人透明质酸，经进一步处理可得到重组人透明质酸盐。(一)一种与人体同源的重组人透明质酸酶，本专利技术使用的重组人透明质酸酶为人透明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白(人白蛋白或免疫球蛋白)片段的融合蛋白，其氨基酸序列含有644个氨基酸残基，具有人体同源性高、半衰期长的优点。从结构上看重组人透明质酸酶分子有形成二硫键的8个Cys，5个N-糖基化位点Asn-Ala-Thr、Asn-Arg-Ser、Asn-Gly-Ser、Asn-Glu-Ser、Asn-Val-Thr，3个酶活位点，这些功能结构的存在可以提高重组人透明质酸酶的稳定性，延长半衰期，同时还可以增加重组人透明质酸酶的活性和功能化作用。进一步研究发现重组人透明质酸酶分子的4个二硫键位置为Cys25-Cys316、Cys189-Cys203、Cys341-Cys571、Cys429-Cys481，5个N-糖基化位点为Asn47-Ala48-Thr49、Asn131-Arg132-Ser133、Asn200-Gly201-Ser202、Asn219-Glu220-Ser221、Asn333-Val334-Thr335，3个酶活位点为Asp111、Glu113、Gln276。活性中心即底物结合部位，位于在C-末端与β折叠之间的凹槽内，活性基团Asp111、Glu113处于凹槽内无规则松散区，底物(D-葡萄糖醛酸-N-乙酰葡糖胺)3-10多聚体恰好嵌在凹槽内，一定的酶切条件下可以得到包含3-10个双糖单位与人体同源性的小分子透明质酸寡糖片段。其中Glu113为质子供体，而透明质酸的N-乙酰基团为极性亲核体，两者在紧密的特异性结合下进行酶切作用，形成同源性酶切末端，酶活基团的位置十分奇特类似于细菌几丁质酶。(二)上述人体同源的重组人透明质酸酶制备方法一种与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，包括如下步骤：1)通过PCR方法将融合蛋白重组人透明质酸酶的目的基因构建到富含GC的动物细胞表达载体pMH3、pMH4或pMH5中；2)制备表达质粒后，稳定转染到无血清悬浮培养的CHO细胞中；通过G418筛选，用枪头手动挑取稳定克隆到96孔板中；3)当细胞汇合度大于50％时，更换无血清新鲜培养基；4)3-6小时后，收集培养基样品，通过抗体点杂交或ELISA方法检测表达量，选出表达量最高的多个克隆子，继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；5)选出传代稳定的克隆子在5-8L激流式反应器内进行扩增培养，在各批次丰收液中选取透明质酸酶活性浓度达到600-1000U/L的培养液。优选地，所述的与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，在步骤5)之后还包括如下步骤：1)对步骤5)中获得的培养液进行离心并过滤，制得融合蛋白重组人透明质酸酶粗品；2)用人源蛋白特异性纯化方法对融合蛋白重组人透明质酸酶粗品进行纯化。纯化以后，纯度在95％以上，收率大于32％，纯化产量符合进一步做皮下注射药物的要求。进一步地，所述的与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，离心采用的转速为5000-8000rpm，离心时间为6-10min。进一步地，所述的与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，取离心后的上清液用三层滤膜进行过滤，滤膜孔径分别为0.8μm、0.45μm、0.22μm。制备方法的优势①含有人源蛋白片段的重组人透明质酸酶酶切得到的重组人透明质酸具有人体同源性酶切末端，可以与人体内特定的受体及结合蛋白特异性结合，引起人体生物学效应；②人源蛋白片段融合人透明质酸酶后，延长了重组人透明质酸酶在反应中的半衰期；③与聚乙二醇化学偶联的人透明质酸酶rHuPH20相比，融合蛋白重组人透明质酸酶是全同人源蛋白质，使用更安全，虽然融合蛋白重组人透明质酸酶体外活性(比活性)降低，但是其体内活性更加优越；④融合蛋白重组人透明质酸酶在哺乳动物细胞生产后，可实现工业化生产水平，同时可采用纯化人源蛋白片段的特异方法进行高度纯化，提高产量；⑤该融合蛋白重组人透明质酸酶可用来酶切大分子透本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与人体同源的重组人透明质酸，其特征在于，该重组人透明质酸结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种与人体同源的重组人透明质酸，其特征在于，该重组人透明质酸结构式如下：其中n＝3-10，结构式两端是与人体同源性酶切末端。2.如权利要求1所述的使用与人体同源的重组人透明质酸酶制备重组人透明质酸，其特征在于，本发明使用的重组人透明质酸酶为人透明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白(人白蛋白或免疫球蛋白)片段的融合蛋白，其氨基酸序列含有644个氨基酸残基，具有人体同源性高、半衰期长的优点。3.如权利要求2所述的与人体同源的重组人透明质酸酶，其特征在于，制备方法包括如下步骤：1)通过PCR方法将融合蛋白重组人透明质酸酶的目的基因构建到富含GC的动物细胞表达载体pMH3、pMH4或pMH5中；2)制备表达质粒后，稳定转染到无血清悬浮培养的CHO细胞中；通过G418筛选，用枪头手动挑取稳定克隆到96孔板中；3)当细胞汇合度大于50％时，更换无血清新鲜培养基；4)3-6小时后，收集培养基样品，通过抗体点杂交或ELISA方法检测表达量，选出表达量最高的多个克隆子，继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；5)选出传代稳定的克隆子在5-8L激流式反应器内进行扩增培养，在各批次丰收液中选取透明质酸酶活性浓度达到600-1000U/L的培养液。4.如权利要求3所述的与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，其特征在于，在步骤5)之后还包括如下步骤：1)对步骤5)中获得的培养液进行离心并过滤，制得融合蛋白重组人透明质酸酶粗品；2)用人源蛋白特异性纯化方法对融合蛋白重组人透明质酸酶粗品进行纯化。5.如权利要求3所述的与人体同源的重组人透明质酸酶制备方法，其特征在于，离心采用的转速为...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺晓军，
申请(专利权)人：杭州惠博士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33