一种同人源胶原蛋白氨基酸、基因序列及蛋白氨基酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种同人源胶原蛋白氨基酸、基因序列及蛋白氨基酸的制备方法。同人源胶原蛋白氨基酸具有SEQ ID No:1序列；表达同人源胶原蛋白氨基酸的基因具有SEQ ID No:2序列；一种表达上述同人源胶原蛋白氨基酸的方法包括如下步骤：制备质粒、毕赫酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组同人源胶原蛋白的发酵、基因重组同人源胶原蛋白的纯化。本发明专利技术设计的基因序列能高效、高产量地表达同人源胶原蛋白氨基酸；所制备的同人源胶原蛋白氨基酸具有纯度高、活性好的特点。

Preparation of a kind of human collagen amino acid, gene sequence and protein amino acid in the same human source

The invention discloses a preparation method of human collagen amino acid, gene sequence and protein amino acid of the same human source. One source with SEQ ID collagen amino acid sequence of No:1; the expression of human source gene has SEQ collagen amino acid sequence of No:2 ID; a method of expressing the human source collagen amino acid comprises the following steps: preparing plasmid, Pichia yeast transformation, Hector copy inserted recombinants screening, gene recombinant human source collagen fermentation, recombinant human collagen purification source. The gene sequence designed by the invention can express human collagen collagen amino acid efficiently and high yield, and the prepared human collagen amino acid has the characteristics of high purity and good activity.

【技术实现步骤摘要】
一种同人源胶原蛋白氨基酸、基因序列及蛋白氨基酸的制备方法
本专利技术涉及遗传工程领域，特别涉及一种同人源胶原蛋白氨基酸、基因序列及蛋白氨基酸的制备方法。
技术介绍
胶原蛋白(Collagen)是一种生物性高分子物质，是人体的一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质，对人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，起着支撑、修复、保护三重抗衰老作用。在分子结构上，胶原蛋白是由平行线型链组成，每一线型链由三条扭曲左旋的α-肽链通过链间相互作用紧密结合而形成的一极强的右旋三重螺旋结构，每条α-肽链由多达300个以上的Gly-X-Y三联体重复构成，X、Y分别为氨基酸，两端连接具有不同结构的其它小片段。分子量在1000道尔顿以下的小分子胶原蛋白无需分解可被人体直接吸收，可以滋润肌肤，赋予其平滑感觉，可以说是真皮层强有力的后盾，其对皮肤的作用不言而喻；胶原蛋白加入护肤类化妆品中，与其它原料配伍性佳，协同效果良好，能对受损肌肤有效好的修复作用；口服纯胶原蛋白1个月后，普遍反映肤感细腻、润滑、细小皱纹得到很好的舒展，肤色有所增白；头发和皮肤一样，也是由胶原蛋白组成，胶原蛋白主要控制着头发的粗细，弹性和湿润度，缺乏胶原蛋白，头发会干枯分叉，灰暗无光泽。由于胶原蛋白可以补充皮肤所需要的营养，使皮肤中胶原活性增强，有滋润皮肤，延缓衰老、美容、消皱、养发等功效，因此被广泛应用在生物医药和化妆品等行业中。胶原蛋白的传统生产方法主要是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)，从中提取胶原蛋白，但这些方法提取的胶原蛋白不仅成分复杂纯度低而且丧失了原本的生物学活性，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，因此无法应用于生物医学和化妆品领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备同人源胶原蛋白，不仅解决了传统生产方法的诸多缺点，也筛选出了当前国内外最佳制备同人源胶原蛋白的方法和表达体系。据报道巴氏毕赤酵母表达系统之所以能够高效地表达外源基因制备同人源胶原蛋白，与其独特的生物学和遗传学特性是分不开的。与开发最早最普遍应用的大肠杆菌表达系统相比，巴氏毕赤酵母表达系统产量高，产物纯化简单，且生物学活性好；与最早开发的酵母类表达系统——酿酒酵母表达系统相比，它营养要求低，重组子稳定性好，且含有严格的甲醇诱导表达机制的相关基因，表达效率高。目前，已有数百种外源蛋白在巴氏毕赤酵母表达系统中成功表达。虽然巴氏毕赤酵母表达系统具有高效表达外源基因的能力，但并不是每个实验室构建的表达系统都能够高效表达同人源胶原蛋白，它受影响的因素较多，如外源基因、信号肽、基因拷贝数、发酵条件、蛋白稳定性等因素都会对其高效表达产生影响。
技术实现思路
本专利技术为了提供一种使用巴氏毕赤酵母表达系统高效表达同人源胶原蛋白的方法，经过对各影响表达因素的综合分析和选择性优化，构建了一套优化的巴氏毕赤酵母高效表达系统。(一)影响表达的因素优化a、外源基因的优化外源基因的特性是决定表达成效的首要因素。5′-UTR(untranslatedregions,非翻译区)过长或过短都不利于蛋白质的最优化生产，高效表达的AOX1的mRNA的前导肽长度为114个氨基酸，且含有丰富的A+U，因此同人源胶原蛋白合成最理想的条件是5′-UTR应尽可能靠近AOX1启动子基因的mRNA，并保持一致；控制A+T的含量在30％-55％之间表达效果最佳，因为过高的A+T有时会造成转录的提前终止；巴氏毕赤酵母在密码子的使用上存在偏爱性，其中Phe的TTC、Leu的TTG、Ile的ATT、Ile的ATC、Val的GTT、Val的GTC、Ser的TCT、Ser的TCC、Pro的CCA、Thr的ACT、Thr的ACC、Ala的GCT、Tyr的TAC、His的CAC、Lys的AAG、Asp的GAC、Glu的GAG、Arg的AGA、Gly的GGT共19个密码子被确认为巴氏毕赤酵母的高表达优越密码子。b、信号肽的优化为方便蛋白的分离纯化，同人源胶原蛋白的生产应采用分泌表达的方式。同人源胶原蛋白的分泌表达可以利用巴氏毕赤酵母的α-因子前导肽序列来引导分泌。经过改造过的人α-fucosyltransferase因子在GS115中获得表达，可溶性蛋白产物可以在α-因子信号的引导下，通过高尔基体分泌到胞外。巴氏毕赤酵母细胞膜上有一种KEX2样蛋白水解酶，能专一性水解α-因子前体中羧基端的肽键，从而保证了蛋白加工过程中的信号肽的切除。c、重组质粒的优化Col1基因在克隆到pPIC9K之前要导入到pPIC9载体中的α-因子信号肽基因之后，是因为虽然pPIC9K载体比之前者多了一个抗卡那霉素的基因可以用卡那霉素或是遗传霉素(G418)来做筛选，但其上的XhoI位点非单一。重组质粒pPIC9K-Col1进行线性化和浓缩来提高同人源胶原蛋白的高效表达。d、基因拷贝数的优化适当增加外源基因整合到巴氏毕赤酵母染色体上的拷贝数是提高外源基因表达量的基本策略，但是整合过多外源基因的拷贝数可能导致重组DNA的不稳定，目前筛选多拷贝转化子大多采用抗生素的方法，利用基因剂量效应,依靠G418的抗性水平来快速筛选出高拷贝的整合转化子，并通过PCR分析外源基因拷贝数,该方法可以有效提高同人源胶原蛋白表达量、简化实验操作、节约时间。e、发酵条件的优化溶氧量是影响表达水平的极为重要的因素，甲醇代谢过程中需要很高的溶氧量，因此在发酵过程中及时补充巴氏毕赤酵母代谢所需要的氧气对于同人源胶原蛋白的产量是至关重要的，一旦溶氧受到限制，同人源胶原蛋白的表达量也将会受到限制；碳源也是影响高效表达的重要因素，巴氏毕赤酵母表达培养基常用的碳源是甘油，但甘油对AOX启动子有抑制作用，用山梨糖醇复配甘油作为碳源,可以有效提高同人源胶原蛋白的表达；温度对巴氏毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质及生物合成方向等都有影响，温度升高,反应速率加大，生长代谢加快，但温度过高，又会使酶易因热而失去活性，菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的产量，因此，必须选择合适的温度表达同人源胶原蛋白，在发酵生产中可以采用变温发酵策略来提高产量，即诱导表达时的温度要比菌体生长时的温度低；巴氏毕赤酵母生长的pH值范围比较宽，因此应当选择适宜同人源胶原蛋白表达的pH值，如真菌免疫调节蛋白在pH值5.8-8.0时,随着pH值逐渐增加到8.0，表达量达到最高，但对于巴氏毕赤酵母来说，其生长和表达的最适pH值也并不相同；在发酵过程中，需要定期补加一定量的诱导剂甲醇以补偿甲醇的挥发和消耗，补加甲醇的终浓度、甲醇的诱导方式、诱导温度及诱导时间都会影响同人源胶原蛋白的表达水平，所以具体条件还需要根据具体试验而定。f、产物稳定性的优化巴氏毕赤酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶,能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如LySArg、LysLys、ArgArg、LysArg)，巴氏毕赤酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。通过降低培养温度、改变培养基的pH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物,都能够提高同人源胶原蛋白的稳定性。同时，在培养基中加入少量的TritonX-114或蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同人源胶原蛋白氨基酸，其特征在于，所述氨基酸的序列与SEQ ID No:1具有至少85％同源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种同人源胶原蛋白氨基酸，其特征在于，所述氨基酸的序列与SEQIDNo:1具有至少85％同源性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的同人源胶原蛋白氨基酸，其特征在于，所述的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。3.一种编码如权利要求1或2所述同人源胶原蛋白氨基酸的基因序列，其特征在于，所述的基因序列与SEQIDNo:2具有至少85％同源性的基因序列。4.如权利要求3所述同人源胶原蛋白氨基酸的基因序列，其特征在于，所述的基因序列如SEQIDNo:2所示。5.如权利要求3所述同人源胶原蛋白氨基酸的基因序列，其特征在于，所述的基因序列A+T的含量介于30％-55％。6.一种表达如权利要求1或2所述同人源胶原蛋白氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)制备质粒；2)毕赫酵母电转化；3)多拷贝插入重组子的筛选；4)基因重组同人源胶原蛋白的发酵；5)基因重组同人源胶原蛋白的纯化。7.如权利要求6所述同人源胶原蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺晓军，
申请(专利权)人：杭州惠博士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33