一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法技术

本发明专利技术提供一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，解决该麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)在发酵表达过程中产生不可溶蛋白的问题，属于生物工程领域。本方法所用的种子培养基和发酵培养基均为化学成分确定的培养基，培养基成本低廉，不含有任何有机态氮源。利用本发明专利技术的发酵培养基和方法对TRH201菌株进行高密度培养和对目标蛋白MTHase进行诱导，可获得大量可溶性目标蛋白，解决其在发酵表达过程中产生包涵体的问题；本方法与常规方法相比，同等菌量制备得到的MTHase酶活力提高了14.9倍。

Method for preparing malt oligosaccharide based trehalose hydrolyzing enzyme by recombinant Escherichia coli strain

The present invention provides a method for preparing recombinant Escherichia coli strain MTHase, solve the MTHase (MTHase) to produce insoluble protein in fermentation and expression process, belongs to the field of biological engineering. The seed medium and the fermentation medium used in the method are all chemically defined medium, and the culture medium is cheap and contains no organic nitrogen source. Medium and method and the target protein MTHase was induced by high density culture of TRH201 strain by fermentation of the invention can obtain a large amount of soluble target protein, its inclusion in solving the problems in the process of fermentation and expression; compared with the conventional method, the same amount of bacteria producing MTHase enzyme activity produced by the increased 14.9 times.

【技术实现步骤摘要】
一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法
：本专利技术属于生物工程领域。
技术介绍
：海藻糖是一种非还原性二糖，是细胞对环境变化形成的一种典型的应激代谢物。它的分子结构(旋光度和溶解性质)和化学性质特殊，是非常稳定的二糖。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失，维持生物体的正常生命活动，是一天然的生命保护者。海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，因此外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用，因此有人把海藻糖称为“生命之糖”。海藻糖具有抗冷冻性、保湿性、耐高温性、干燥抗性，非还原性，良好的加工特性，化学稳定性，与其它糖类相比，更具安全性、非龋齿性及无异味性，优质甜味，低热值，防龋齿等特性，因此可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业等。因此，海藻糖具有广泛的应用前景和较高的商业价值。目前国内外常见的生产海藻糖的方法有三种：一是生物细胞提取法；二是微生物发酵生产法；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，利用酶法合成海藻糖，这也是目前发酵生产海藻糖的主流方法。其中，酶法合成海藻糖主要指由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)双酶共同作用于淀粉或麦芽糊精生成海藻糖，反应产物主要为海藻糖，以及少量副产物(如葡萄糖、麦芽糖等)。双酶法以淀粉为原料，生产成本低，且副产物少，易于产物的分离纯化，适合工业化生产。实验菌株大肠杆菌中的E.coli表达系统是基因工程中最常用的外源蛋白表达系统，但E.coli表达系统表达的外源蛋白常常容易形成无活性的包涵体，特别是胞内表达的蛋白。目前，提高外源蛋白在大肠杆菌内可溶性表达策略主要有降低蛋白质合成速率、培养基中加入一些添加剂、选择恰当的表达载体和表达宿主、与分子伴侣共表达以及与增溶标签融合表达等。但以上策略对本专利中使用的TRH201菌株表达的MTHase可溶性均无明显的提高作用。
技术实现思路
本专利技术人为了实现TRH201菌株能显著提高MTHase可溶性，经过广泛的研究和实验，找到了一种提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)在大肠杆菌中可溶性表达的方法。本专利技术的主要方法包括：重组大肠杆菌高密度培养的培养基制备；重组大肠杆菌TRH201种子液制备；TRH201高密度培养的菌体增长阶段和诱导阶段的调控方法。本方法有如下优势：(1)所用的种子培养基和发酵培养基均为化学成分确定的培养基，该培养基成本低廉，不含有任何有机态氮源，如酵母浸提物、蛋白胨等。(2)本方法在菌体诱导期通过对特定参数的调整，使菌体表达的可溶性MTHase含量大幅提高，克服了该酶在大肠杆菌中可溶性表达量低的技术障碍。(3)采用本方法制备得到的MTHase酶活力是采用常规方法同等菌量的14.9倍，酶活力大幅提高。附图说明图1MTHase优化前蛋白样品图。图2MTHase优化后蛋白样品图。图3海藻糖出峰位置HPLC图。图4海藻糖标准曲线图。图5MTHase酶活测定曲线图。具体实施方式：下述实施方式中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施方式中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施方式中的种子培养基(LB培养基)组成：1％蛋白胨，0.5％酵母浸提粉，1％氯化钠，pH约7.0。下述实施方式中的ZYM自诱导培养基为无菌培养基，其成分如下：100mLA+2mLB+2mLC+200μLD+100μLE；A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；B为50×M溶液，50×M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25MNa2HPO4，1.25MKH2PO4，2.5MNH4Cl和0.25MNa2SO4；C为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)L-阿拉伯糖；D为1MMgSO4水溶液；E为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mMFeCl3，20mMCaCl2，10mMMnCl2，10mMZnSO4，2mMCoCl2，2mMNiCl2，2mMNa2Mo4，2mMNa2SeO3，2mMH3BO3。下述实施方式中的大肠杆菌BW25113在文献“TomoyaBaba,TakeshiAra,MikiHasegawa,YukiTakai,YoshikoOkumura,MikiBaba,KirillADatsenko,MasaruTomita,BarryLWanner,andHirotadaMori1.ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-geneknockoutmutants:theKeiocollection.MolecularSystemsBiology(2006):1-11.”中公开过，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。本专利技术涉及重组大肠杆菌菌株TRH201和TRS101，其遗传学信息如下:菌株TRH201、TRH101分别是由pBAD-MTH载体、pBAD-MTS载体转化至大肠杆菌BW25113宿主菌中获得。pBAD-MTH载体为将序列1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的编码基因的DNA片段替换pBAD载体(Invitrogen，产品目录号：V430-01)的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase。pBAD-MTS载体为将序列2所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)的编码基因的DNA片段替换pBAD载体(Invitrogen，产品目录号：V430-01)的XhoI和EcoRI酶切位点间的片段，且保持pBAD载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase。分别将上述测序验证正确的表达载体转化至大肠杆菌BW25113感受态细胞中，得到重组菌pBAD-MTH/BW25113、pBAD-MTS/BW25113。对上述2株重组菌进行菌液PCR验证，结果表明2株菌均正确，扩增条带大小与目标条带大小相同。将重组菌pBAD-MTH/BW25113命名为TRH201，将重组菌pBAD-MTS/BW25113命名为TRS101。下述实施方式中的MTHase酶活力测定，其步骤包括：(1)在冰浴条件下配制转化液，转化液中成分包括：DE15麦芽糊精300g/L，pH7.0PBS缓冲液0.02M，普鲁兰酶(食品级杰能科，锐阳生物)5ml/L，MTSase粗酶6ml/L。待测MTHase粗酶0.5ml/L。所述MTSase粗酶，指的是指由TRS101经培养后的菌体，用高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，包括：重组大肠杆菌TRH201种子液制备，其包括将冻存的菌种以1％的接种量，接种到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养8小时得到一级种子；再将一级种子以4％的接种量，接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养6小时得到二级种子，二级种子的OD600nm为1.5‑2.5；TRH201高密度培养的菌体增长阶段的调控方法，其包括将二级种子以10％的接种量接种到发酵培养基装液量为40％的发酵罐中，发酵罐通气量为1‑3vvm，转速为300‑1200rpm，溶氧控制在20‑30％，溶氧偶联转速，pH为6.8‑7.2，以浓度为5M氨水控制pH，培养温度为37℃；当发酵时间为8h时，发酵液溶氧瞬间上升，即发酵液中初始葡萄糖耗尽，立即启动补料培养基的补料，补料速率为10ml/(L·h)；TRH201高密度培养的菌体诱导阶段的调控方法，其包括；当菌体的OD600nm达到40，将温度于30min内缓慢调整至28℃，并将pH于30min内缓慢调整至8.2，待上述两项参数稳定后，加入终浓度为0.02％的L‑阿拉伯糖启动诱导，同时，将补料速率调整至8ml/(L·h)。发酵时间达到24h‑28h时，停止发酵，并收集菌体，用pH7.0的0.05M PBS缓冲液重悬至OD600nm＝400，用高压匀质机破碎菌体，得到MTHase破碎液。...

【技术特征摘要】
1.一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，包括：重组大肠杆菌TRH201种子液制备，其包括将冻存的菌种以1％的接种量，接种到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养8小时得到一级种子；再将一级种子以4％的接种量，接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养6小时得到二级种子，二级种子的OD600nm为1.5-2.5；TRH201高密度培养的菌体增长阶段的调控方法，其包括将二级种子以10％的接种量接种到发酵培养基装液量为40％的发酵罐中，发酵罐通气量为1-3vvm，转速为300-1200rpm，溶氧控制在20-30％，溶氧偶联转速，pH为6.8-7.2，以浓度为5M氨水控制pH，培养温度为37℃；当发酵时间为8h时，发酵液溶氧瞬间上升，即发酵液中初始葡萄糖耗尽，立即启动补料培养基的补料，补料速率为10ml/(L·h)；TRH201高密度培养的菌体诱导阶段的调控方法，其包括；当菌体的OD600nm达到40，将温度于30min内缓慢调整至28℃，并将pH于30min内缓慢调整至8.2，待上述两项参数稳定后，加入终浓度为0.02％的L-阿拉伯糖启动诱导，同时，将补料速率调整至8ml/(L·h)。发酵时间达...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗伟，晏礼明，李海涛，温雅，陈笑，陶勇，林白雪，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京,11