包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途制造技术

提供了一种重组微生物，所述微生物包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰，一种使用其生产纤维素的方法以及一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法。

Genetically modified microorganism containing increased pyruvate phosphate two kinase activity and its uses

A recombinant microorganism is provided, the microorganism contains gene modification that increases the activity of pyruvate phosphoric acid two kinase, a method of using it to produce cellulose and a method for producing microbes with enhanced cellulose production capacity.

【技术实现步骤摘要】
包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月26日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2016-0140178的优先权，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。
技术介绍
1.专利
本申请涉及包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法。2.相关技术说明通过培养微生物生产的纤维素存在作为一级结构的由葡萄糖组成的β-1,4葡聚糖以及由β-1,4葡聚糖形成的原纤维束的网状结构。这种纤维素也被称为“微生物纤维素”。与植物纤维素不同，这种微生物纤维素是完全不含木质素或半纤维素的纯纤维素。与植物纤维素相比，微生物纤维素的宽度为100nm或更窄，并且其具有吸湿性高、吸水能力强、拉伸强度高、弹性高、耐热性高等特点。由于具有这些特征，已将微生物纤维素开发用于诸如化妆品、医疗产品、膳食纤维、音频扬声器隔膜、功能膜等的多个领域。已报道醋杆菌、农杆菌、根瘤菌(Rhizobia)或八叠球菌(Sarcina)是生产微生物纤维素的菌株。已知其中的木驹形杆菌(Komagataibacterxylinus)(也称为“木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)”)就是一个极好的菌株。在需氧条件下进行静态培养时，在培养基表面上形成具有三维网状结构的纤维素薄膜。丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)是属于转移酶家族的酶，其催化下述化学反应：尽管具有如上所述的现有技术，但仍存在对具有增强的纤维素生产能力的重组微生物的需求。专利技术概述本专利技术的一个方面提供了一种包含增加丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)活性的基因修饰的重组微生物。本专利技术的另一个方面提供了一种生产纤维素的方法，所述方法包括在培养基中培养重组微生物；并且从培养物中分离纤维素，所述重组微生物包含增加PPDK活性的基因修饰。本专利技术的又一个方面提供了一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法，所述方法包括将增加PPDK活性的基因修饰引入微生物。附图说明从以下结合附图对实施方式的描述中，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更易于理解，其中：图1显示了在振荡培养条件下引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)菌株的纤维素纳米纤维(CNF)生产情况和葡萄糖消耗情况；图2显示了根据焦磷酸盐(PPi)浓度的K.xylinus(△gdh)(对照组)和引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)(实验组)的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况；以及图3显示了根据Mg2+浓度的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。专利技术详述如在本申请中所使用，术语“活性增加”或“增加的活性”可以指细胞、蛋白或酶活性可检测的增加。“活性增加”或“增加的活性”还可以指经修饰(例如经基因工程改造)的细胞、蛋白或酶的活性水平高于相同类型的比较细胞、蛋白或酶，如不具有给定基因修饰的细胞、蛋白或酶(例如原始或“野生型”的细胞、蛋白或酶)。“细胞活性”可以指细胞的特定蛋白或酶的活性。例如，经修饰或工程改造的细胞、蛋白或酶的活性与相同类型的未经工程改造的细胞、蛋白或酶(即野生型细胞、蛋白或酶)的活性相比可能增加约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高或者约100％或更高。可以采用本领域公知的任何方法对具有增加的蛋白或酶活性的细胞进行鉴定。可以通过增加其表达或特定活性实现增加酶或多肽的活性。可以通过将编码酶或多肽的多核苷酸引入细胞，通过增加其拷贝数或者通过修饰多肽的调控实现表达增加。在其中引入编码该酶的多核苷酸的微生物可以是内源性地含有或不含该多核苷酸的微生物。编码该酶的多核苷酸可以与能够使其表达的调控序列可操作地连接，例如例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化位点或其组合。拷贝数增加的多核苷酸可以是内源性的或外源性的。内源性基因指已经存在于微生物遗传物质中的基因。外源性基因指从外部引入细胞中的基因，并且其相对于引入该基因的宿主细胞可以是同源性或异源性的。术语“异源性”指相对于该物种是“外源性的或非天然的”。可以通过引入或扩增该基因引起，以及可以通过对细胞进行基因工程改造以使得该细胞具有在非基因工程改造的细胞中不存在的基因实现术语“拷贝数增加”。可以由媒介如载体介导基因的引入。引入可以是瞬时引入，在其中基因未整合至基因组，或者引入使得基因整合至基因组。例如可以通过将载体引入细胞，该载体包含编码目标多肽的多核苷酸，然后在细胞中复制载体或通过将多核苷酸整合至基因组进行引入。基因的引入可以通过公知的方法进行，如转化、转染或电穿孔。基因可以通过媒介或通过自身引入。如在本申请中使用的，术语“媒介”或“载体”指能够将与其连接的其他核酸递送进入细胞的核酸分子。作为介导特定基因引入的核酸序列，所使用的媒介可以是载体、核酸构建体或表达盒。载体可以包括例如质粒载体、来源于病毒的载体等。载体可以包括例如质粒表达载体、病毒表达载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)或其组合。此外，如在本申请中使用的，术语“失活”或“降低的”活性指细胞具有的酶或多肽的活性低于在亲本细胞(即未进行基因工程改造的细胞)中检测到的相同活性。而且，“失活”或“降低的”活性指分离的酶或多肽具有的活性低于原始或野生型酶或多肽的相同活性。例如，经修饰(例如经基因工程改造)的细胞或酶具有的将底物转化为产物的酶促活性与不具有修饰的细胞或酶(即亲本细胞或“野生型”细胞或酶)相比显示出约5％或更高、约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高或者约100％的降低。可以通过本领域公知的任意方法对酶或细胞降低的活性进行确证。失活或降低包括与具有未被修饰基因的细胞(即亲本细胞或野生型细胞)相比酶不具有活性，即使酶被表达但具有降低的活性或者编码酶的基因不表达或以较低水平表达的情形。可以通过缺失或破坏编码酶的基因将酶的活性失活或降低。基因的“缺失”或“破坏”指将部分或全部基因或者部分或全部基因的调控序列(例如启动子或终止区)突变，这样与天然存在的基因产物相比，基因不表达，以降低的水平表达或者所表达的基因产物(例如酶)不具有活性或具有降低的活性。突变可以包括基因的一个或多个核苷酸的添加、取代、插入、缺失或转化。基因的缺失或破坏可以通过基因操作如同源重组、定向诱变或分子进化实现。当细胞包括多个相同的基因或者基因的两个或多个旁系同源基因时，可以将一个或多个基因除去或破坏。例如，可以通过同源重组引起酶的失活或破坏或者可以通过使用包含部分基因序列的载体转化细胞，培养细胞以使得该序列可以与细胞的内源性基因同源重组以缺失或破坏该基因，然后使用选择标记选择发生了同源重组的细胞进行酶的失活或破坏。可以使用本领域公知的分子生物学方法进行本公开中使用的基因修饰。术语“亲本细胞”指原始细胞，例如与经过工程改造的微生物是相同类型的未经过基因工程改造的细胞。对于特定的基因修饰而言，“亲本细胞”可以是缺乏特定的基因修饰，但是所有其他方面是相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组微生物，所述重组微生物包含增加丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)活性的基因修饰。

【技术特征摘要】
2016.10.26 KR 10-2016-01401781.一种重组微生物，所述重组微生物包含增加丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)活性的基因修饰。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述基因修饰增加编码所述PPDK的基因的拷贝数。3.根据权利要求1所述的重组微生物，所述PPDK是来自梭菌(Clostridium)属、驹形杆菌(Komagataeibacter)属、丙酸杆菌(Propionibacterium)属、醋杆菌(Acetobacter)属，农杆菌(Agrobacterium)属或埃希氏菌(Escherichia)属的PPDK。4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述PPDK属于EC2.7.9.1。5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述PPDK是与SEQIDNO:1至4所示的任一氨基酸序列具有95％或更高的序列同一性的多肽。6.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述基因与SEQIDNO:5至8所示的任一核苷酸序列具有95％或更高的序列同一性。7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物属于梭菌属、驹形杆菌属、丙酸杆菌属、醋杆菌属，农杆菌属或埃希氏菌属。8.根据权利要求1所述的重组微生物，所述微生物还包含降低膜结合葡萄糖脱氢酶活性的基因修饰。9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李弘顺，姜珍圭，朴轸焕，梁东植，
申请(专利权)人：三星电子株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR