乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法技术

本发明专利技术涉及产乳酸的酵母属微生物，其具有减弱的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和提高的醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性，以及由通过培养该微生物获得的培养液生产乳酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法
本专利技术涉及产乳酸的重组酵母属(Saccharomycessp.)微生物，以及通过培养所述微生物由包含其的培养基生产乳酸的方法。
技术介绍
通常，乳酸是具有包括食品添加剂如食品防腐剂、香精、或酸化剂等广泛应用的重要有机酸，并已广泛用于工业目的，如化妆品工业、化学工业、金属工业、电子工业、纺织工业、染色纺织品工业和制药工业等。另外，乳酸是生物可降解塑料之一的聚乳酸的必需组分，因此，对乳酸的需求已显著提高。乳酸也用作制备多种化合物的重要原料，该化合物包括聚乳酸、乙醛、聚丙二醇、丙烯酸、2，3-五硫酮(2，3-pentathione)等。特别地，D型乳酸是用于生产立构复合物PLA的必需组分，该立构复合物PLA是生产高耐热PLA的必需光学异构体。特别地，用于生产乳酸的方法包括传统化学合成法和生物发酵法。当乳酸是经由化学合成法生产的时，乳酸以外消旋混合物的形式产生，该外消旋混合物由50％的D型乳酸和50％的L型乳酸构成，控制该组成比例是困难的，因此，由此生产的聚乳酸可以变为具有低熔点的无定形聚合物，从而限制了其使用的发展。在另一方面，根据所用的菌株，生物发酵法能够选择性地生产D型乳酸或L型乳酸。因此，由于后者可以产生特定异构体(isoform)的乳酸，其在商业上是优选的。同时，通过引入用于转化为D型乳酸的酶的基因，已做出尝试经由使用具有D型乳酸生产能力的酵母属微生物的各种基因操作以提高乳酸生产率。具体来说，已做出尝试通过加强乳酸脱氢酶(LDH)的活性同时降低丙酮酸脱羧酶(PDC)的活性、醛脱氢酶(ALD)的活性和/或乙酰辅酶A合成酶(ACS)的活性以提高乳酸生产率(美国专利申请公开第2012-021421号、第2010-0248233号和第2006-0148050号)。然而，由于产乳酸菌株的低细胞生长，总发酵生产率是低的。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术人已做出许多努力以获得乳酸生产率提高的、细胞生长高效的、同时PDC活性降低的微生物。结果是，已证实了其中PDC同种型(isotype)活性可控的、醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高的菌株能够提高乳酸的产量，并促进菌株的细胞生长，从而提高总乳酸发酵生产率，这使得本专利技术得以完成。技术方案本专利技术的目的是提供乳酸生产率提高的酵母属微生物。本专利技术的另一目的是提供使用酵母属微生物生产乳酸的方法。有利效果本专利技术涉及使用通过控制PDC同种型活性、提高醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性而具有提高的乳酸发酵生产率的微生物。因此，所述微生物可以广泛用于乳酸发酵生产工业。附图说明图1是示出酵母属微生物的乳酸产生途径、醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径之间关系的示意图。最佳实施方案在本专利技术的第一方面，为了实现上述目的，提供了乳酸生产率提高的酵母属微生物，其中该微生物是经突变的，使得(a)丙酮酸脱羧酶(PDC)活性相比未经突变的产乳酸菌株降低；(b)醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性相比未经突变的产乳酸菌株提高。通常，产乳酸的酵母属微生物经由乳酸脱氢酶(LDH)利用丙酮酸作为底物而产生乳酸。醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径被阻断，所述醇发酵途径和乙酰辅酶A产生途径是使用丙酮酸作为通用底物的代表性代谢途径。降低PDC活性可以有助于乳酸的生产及其产量的提高，然而，当降低的水平达到一定水平时，产生了不足量的胞质(cytosolic)乙酰辅酶A，其反过来阻断细胞生长，因此不能实现正常发酵。因此，本专利技术人通过提高总乳酸发酵生产率而研发了乳酸生产率提高的酵母属微生物，其中通过将乙酰辅酶A途径调节在最低水平来维持微生物的生长率并提高乳酸产量。本文所用的术语“丙酮酸脱羧酶(PDC)”指具有能够介导从丙酮酸产生碳酸和乙醛的反应的活性的蛋白质，但不限于具有相同活性的其任何衍生物或同种型。已经知道该蛋白质涉及醇发酵的步骤，并大多存在于酵母和植物中。本专利技术的丙酮酸脱羧酶可以固有存在于酵母属微生物中，或可以是PDC1、PDC5和/或PDC6，或特别地是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC1、PDC5和/或PDC6，但不限于此。该蛋白质可以包括其任何变体或类似物，只要它们是生物学相同的且具有与该蛋白质相当的活性。该蛋白质的氨基酸序列可以从已知的数据库等获得，例如NCBI的GenBank等，但不限于此。特别地，PDC1可以由SEQIDNO：71的氨基酸序列构成，PDC5可以由SEQIDNO：72的氨基酸序列构成，PDC6可以由SEQIDNO：73的氨基酸序列构成。与以上列出的氨基酸序列中的每一个相比，该蛋白质可以包括同源性大于70％、特别地大于80％、更特别地大于90％、甚至更特别地大于95％的氨基酸序列。由基因密码简并获得的、编码相同氨基酸序列的以上列出的序列的任何变体也可以包括在本专利技术中。本文所用的术语“同源性”指多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的相似程度，是代表与本专利技术的氨基酸序列或核苷酸序列具有相同序列的序列单元，具有等于或大于上述可能性的可能性。这种同源性可以通过用肉眼比对两个给定序列来确定，更确切地说，其可以使用序列比对程序来确定，该序列比对程序是容易得到的，其通过将待比对序列并排排列以解释同源性程度。本领域已知的序列比对程序包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和包含CLUSTALW的软件等。已报道了关于通过使PDC1缺陷而生产乳酸的大量实例，PDC1在乳酸生产中表现出主要的活性(ApplMicrobiolBiotechnol.2009，82(5)：883-90)。在这种情况下，因为PDC6很少被表达，实际表现出的PDC活性是由于PDC5基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷并不会阻碍野生型菌株的细胞生长，并且相比野生型，约60％至70％的PDC活性可以被保留，因此在菌株中没有观察到显著的表型变化(JBacteriol.1990，172(2)：678-685)。同时，为了最大限度地经由与PDC竞争丙酮酸的LDH途径生产乳酸，可以制备在PDC1、PDC5和PDC6中同时具有三重缺陷的菌株。在这种情况下，可以最大化乳酸发酵产量，但是由于在葡萄糖存在下诱导的分解代谢物阻遏，乙醇和乙酸的代谢能力可以被进一步抑制，从而降低了细胞生长，最终导致发酵生产率降低(CurrGenet.2003/43(3)/139-160)。由于PDC6很少被表达，实际表现出的PDC活性是由于PDC5基因的表达。根据报道，单独的PDC1缺陷不会阻碍野生型菌株的细胞生长，并且相比野生型，约60％至70％的PDC活性可以被保留，因此在菌株中没有观察到显著的表型变化(JBacteriol.1990，172(2)：678-685)。作为替代，可以制备在PDC1和PDC5基因中同时具有双重缺陷的菌株，所述PDC1和PDC5基因在酵母中表现出主要的PDC活性。在这种情况下，在缺乏共底物例如乙酸或乙醇时，可以使用糖源例如糖原进行乳酸发酵。然而，由于PDC活性的快速降低，导致酵母菌株的生长率降低，从而降低了乳酸发酵生产率(BiosciBiotechnolBiochem.2006，70(5)：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸生产率提高的经分离的酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种乳酸生产率提高的经分离的酿酒酵母微生物，其中所述微生物是经修饰的，使得：a)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低；b)相比未经修饰的产乳酸菌株，所述微生物的醛脱氢酶(ALD)活性和乙酰辅酶A合成酶(ACS)活性提高。2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述丙酮酸脱羧酶选自PDC1、PDC5和PDC6中的至少一种。3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述微生物是经修饰的以：i)使PDC1活性失活，降低...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁殷彬，李泰熙，金善慧，宋规显，河哲雄，罗景洙，梁荣烈，姜玟先，李孝炯，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR