一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种稻瘟病抗性基因座

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记及其应用
本专利技术属于农业生物
，特别涉及一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记及其应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病害是世界水稻产区最重要的病害（Qu1985，Maetal.2015）。生产实践表明，利用抗病基因选育抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的措施。但由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，单一抗性品种的抗性往往会在种植后的3〜5年时间里逐渐丧失；因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是抵御稻瘟病菌的有效手段。近年来，随着分子遗传学的发展，至少有100多个位点和25个抗性基因得以被精细定位或克隆。另外，更加准确有效的分子标记的发展及应用，也逐渐替代了传统的接种鉴定方法。在已克隆的抗性基因中，一些抗病基因位于同一位点，这些复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种材料的功能抗病基因。因此，直接分析功能等位基因的保守序列并开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。近年来，有关于Pik等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，目前该抗性位点上至今已至少发现有6个不同的抗性基因，已有研究表明，这些抗性基因都具有广谱高抗的特点，在抗病育种中具有很高的应用价值。然而，目前育种中还缺乏简单方便的标记，为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因座Pik应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的功能基因分子标记。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足与缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel。本专利技术的另一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel的检测方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel，是通过引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出与稻瘟病抗性基因座Pik功能基因呈特异性带型的分子标记；Fl:SEQIDNO.1（5’-3’）:AACTGAGTAGGAGGGTGGACAT；Rl:SEQIDNO.2（5’-3’）：TTTTGAGACAAGGCTGACTATA；所述的水稻品种为IRBLk-Ka(Pi-k)、IRBLkp-K60(Pi-kp)、IRBLkh-K3(Pi-kh)、IRBL1-CL(Pi-1)、IRBLkm-Ts(Pi-km)、IRBLKs-s(Pi-ks)；所述的稻瘟病抗性基因座Pik5’-UTR端的序列片段I，I:AACTGAGTAGGAGGGTGGACATATGCAACAAAATAACTTATGGGATGGAATGTCAAACTTCAAATAACTTATGGGGTGGTTTTTTTTCTATATTATTTAATATAGTCAGCCTTGTCTCAAAA。所述的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel的检测方法，通过比对6个水稻稻瘟病抗性基因座Pik两端的等位基因序列，包含以下步骤:(1)从NCBI公共数据库中下载得到Pik基因座功能基因IRBLk-Ka(Pi-k)、IRBLkp-K60(Pi-kp)、IRBLkh-K3(Pi-kh)、IRBL1-CL(Pi-1)、IRBLkm-Ts(Pi-km)、IRBLKs-s(Pi-ks)及其测序品种日本晴(Nipponbare)相对应区域的基因组序列，向基因两端扩增，筛查Pik特异的、能区别于该位点非功能等位基因的插入/缺失(insertion-deletion,InDel)位点；(2)利用步骤(1)获得的InDel信息，根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处上下游100-200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下:Fl:5-AACTGAGTAGGAGGGTGGACAT-3；Rl:5-TTTTGAGACAAGGCTGACTATA-3；(3)以携带有稻瘟病抗性基因Pi1、Pi-k、Pi-kp、Pi-kh、Pi-km和Pi-ks的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因座Pik基因特异性分子标记Pik-InDel；所述的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记Pik-InDel在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，特别适合于在鉴别Pik基因座功能基因的应用；优选包含如下步骤:(1)扩增:利用引物Fl和Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若检测到分子量大小为122bp的核苷酸片段，则携带有稻瘟病抗性基因座Pik的功能基因；若检测到分子量大小为133bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有该位点稻瘟病非功能基因。本专利技术的原理:稻瘟病抗性基因座Pik包含至少有6个抗病基因，这些等位基因间序列高度同源，说明它们可能有共同的亲缘关系。因此，这必然会引起这些抗性基因两端序列的连锁不平衡，即与这些基因紧密相连的两端序列具有保守的共分离关系。InDel（Insert-deletion）标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记(Hytenetal,2010)。InDel标记稳定性好、多态性高、分型系统简单(Janderetal,2002)；与分型系统复杂的SNP标记相比，InDel检测更加简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。本专利技术通过6个功能基因与日本晴序列比对的方法寻找Pik功能基因序列上出现的InDel，由于这个InDel在Pik功能基因与非功能基因有11bp的差异，因此很容易将Pik功能基因从中区分出来。本专利技术据此设计引物对F1/R1，通过常规PCR扩增，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，以不同大小的片断得以呈现。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(1)本专利技术提供的分子标记特异性高:目前已在Pik区域克隆到6个功能基因，这些基因在功能与非功能基因间存在多个重复与高度序列同源(Huaetal.2012)。因此，很难找到适合的区间能将功能基因与非功能基因区分的标记。本专利技术提供的分子标记是本专利技术人经过对6个功能基因与非功能基因的两端序列不断的进行搜查并通过实验验证得到的，能明显地将基因座Pik功能基因与存在于该基因组区域内非功能基因进行区分。(2)本专利技术提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量:目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。本专利技术提供的分子标记只需PCR结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。(3)本专利技术是第一个针对基因座Pik功能基因两端保守InDel开发的分子标记。本专利技术能通过电泳检测的方法成功地将基因座Pik功能基因与非功能基因区分开的共显性标记，到目前为止，还没有有关这类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病抗性基因座

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对序列如SEQIDNO.1-2所示。2.一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记，其特征在于：是通过所述引物对SEQIDNO.1-2从水稻基因组DNA中扩增出与稻瘟病抗性基因座Pik功能基因呈特异性带型的分子标记。3.根据权利要求2所述的一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因座Pik两端的片段I，I序列如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求2所述的稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记的检测方法，其特征在于：通过测序比对水稻稻瘟病抗性基因座Pik等位基因的前后端序列，包含以下步骤:(1)从公共数据库中下载得到的Pik基因座功能基因序列，包含Pik、Pik-s、Pik-m、Pik-p、Pik-h和Pi1，以及测序品种日本晴相对应区域的基因组序列，根据该序列扩增其前后端的序列并进行序列比对，...

【专利技术属性】
技术研发人员：田大刚，王锋，陈松彪，陈在杰，陈子强，林艳，杨立明，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35