一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种稻瘟病抗性基因座

A rice blast resistance gene loci molecular Pi2/9 molecular markers of functional genes and its application

The invention provides a rice blast resistance gene

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因分子标记及其应用
本专利技术属于农业生物
，特别涉及一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9的功能基因特异性分子标记及其应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病害是水稻最重要的病害，给世界水稻的主产区都会造成严重的损失。由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致多数抗性品种会在种植3〜5年时间里逐渐丧失抗性；因此，鉴定和合理利用广谱抗性基因是抗病品种的重要途径。近年来，随着多个水稻稻瘟病抗性基因得以被精细定位或克隆，以及分子标记的发展及应用，促进了抗性基因的鉴定以及多抗病基因聚合育种的发展。但在已克隆的抗性基因中，多数高抗基因成簇分布在同一区域上，如Pi2/9、Pik和Pi-ta等基因座，连锁标记无法将同一基因座的基因分辨开来。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。目前在Pi2/9基因座上已至少发现Pi2,Piz-t，Pi9和Pigm等抗性基因。Pi2的抗谱比较广，已有研究表明该基因对从中国稻瘟小种中的绝大部分表现抗性，其供体亲本C101A5l对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性。Pi9的抗谱也比较广，该基因对世界上多个国家的稻瘟病菌株均表现出很高的抗性。在生产应用表现上，王倩等发现Pi2/9基因座上的基因是东北各地区抗性最好、抗谱最广的抗源。张学堂等和曾凡松等在各自的研究中也证实Piz-t等位基因是当前优良的抗性基因。Pigm是其中较为重要的抗病基因之一，随着该基因被克隆及相关研究成果的发表，我们基本可以确定Pigm是当前最广谱高抗的基因之一。当前，研究者已利用开发出一些该基因座上功能基因的标记。这些标记要么是基于特定亲本间的多态性分析，要么是位于抗性基因的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离。因此，它们只适用于部分亲本间，不宜于种质资源鉴定或抗性资源筛选。即便是功能标记，也只能鉴定出一到两个基因功能基因，因此，为了能更高效方便地将稻瘟病抗性基因座Pi2/9的功能基因应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的基因座Pi2/9功能基因特异的分子标记。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足与缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因功能特异性分子标记Pi2/9-FM。本专利技术的另一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM的检测方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM，是通过引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从水稻品种华占、Toride-1、75-1-127和谷梅4号基因组DNA中扩增出与Pi2,Piz-t，Pi9和Pigm基因呈特异性带型的分子标记；SEQIDNO.1（5’-3’）:CTTATTTCGTTTGCTATGC；SEQIDNO.2（5’-3’）：GGACTATGTGATCGGTTAG；所述的水稻品种为华占（Pi2）、Toride-1（Piz-t）、75-1-127（Pi9）和谷梅4号（Pigm供体亲本）；所述的稻瘟病抗性基因Pigm包括Pi9、Nbs5-Pi9、Pigm-R2的3’UTR片段I和Nbs2-Pi2、Pi2、Pigm-R4和Pigm-R6的NBS-LRR片段II，I:cttatttcgtttgctatgagcaccaatcgtttgctagaatgtctgaaagatcttgtgtacatatggtggactgaacaattgaacattacaagttatcatattttatattgttgctaaccgatcacatagtcc。II:cttatttcgtttgctatgcgcagttgcgcaccaaccgtttgctagaatgtctgaaagagcctatgtacatatggtggcctgaacattacaagttatcatattttatattgttgctagctttcctttcaaaaaaaaaaaattgttcctaaccgatcacatagtcc。所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9的功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM的检测方法，通过比对多个水稻稻瘟病抗性基因座Pi2/9的等位基因序列，包含以下步骤:(1)从公共数据库中下载得到的及其同源的Pi2(DQ352453)、Pi9(DQ285630.1)、Piz-t(DQ352040)和Pigm(KU904633.2)以及测序品种日本晴(Nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对基因座Pi2/9功能基因位点进行序列比对，筛查基因座Pi2/9功能基因特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的多态性位点；(2)利用步骤(1)获得的多态性信息，根据标记的设计原理，在所述多态性位点处上下游100〜200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下:Fl:5-CTTATTTCGTTTGCTATGC-3；Rl:5-GGACTATGTGATCGGTTAG-3；(3)以携带有稻瘟病抗性基因水稻品种为华占（Pi2）、Toride-1（Piz-t）、75-1-127（Pi9）和谷梅4号（Pigm）的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物即为稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM；所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记Pi2/9-FM在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，特别适合于在鉴别Pi2/9基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因的应用；优选包含如下步骤:(I)扩增:利用引物Fl和Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若检测到分子量大小为132bp和164bp的核苷酸片段，则携带有稻瘟病抗性基因Pigm；若检测到分子量大小为132bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有Pi9；若检测到分子量大小为165/166bp,则待检测的水稻品种携带有Pi2/z-t;若没有检测到的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带基因座Pi2/9功能基因。本专利技术的原理：本专利技术通过多序列比对的方法寻找基因座Pi2/9功能基因序列上出现的两个片段，由于这两个片段在不同的功能基因存在情况的差异，在日本晴中不含有该位点，因此很容易将基因座Pi2/9功能基因区分出来。本专利技术据此设计引物对F1/R1，通过常规PCR扩增，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，以不同大小的片断得以呈现。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(1)本专利技术提供的分子标记特异性高:Pi2/9基因簇存在着包括Pi2、Piz-t、Pi9和Pigm等在内的候选基因，这些抗性基因的直系同源间、旁系同源基因间及其相互间都存在高度相似；因此，普通的SSR标记很难将该位点的基因区分开来(Zhouetal.2007;Daietal.2010)。本专利技术提供的分子标记是本专利技术专利技术人经过对Pi2/9基因簇不断的进行序列多态性比较，并通过实验验证得到的，能明显地将Pi2/z-t、Pi9和Pigm从Pi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病抗性基因座

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对序列如SEQIDNO.1-2所示。2.一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9特异性分子标记，其特征在于：是通过权利要求1所述引物对SEQIDNO.1-2从水稻基因组DNA中扩增出与稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因呈特异性带型的分子标记。3.根据权利要求2所述的一种稻瘟病抗性基因座Pi2/9功能基因特异性分子标记，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9包括基因片段I和II，I和II序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.如权利要求2所述的稻瘟病抗性基因座Pi2/9的功能基因特异性分子标记的检测方法，其特征在于：通过比对多个水稻稻瘟病抗性基因座Pi2/9的功能基因序列，包含以下步骤:(1)从公共数据库中下载得到Pi2、Piz-t、Pi9和Pigm基因序列以及测序品种日本晴...

【专利技术属性】
技术研发人员：田大刚，王锋，陈松彪，林艳，陈子强，陈在杰，杨立明，胡昌泉，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35