通过两步法供氧策略提高发酵生产Ｌ－精氨酸产量的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术在钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）ＳＹＰＷ发酵生产Ｌ－精氨酸过程中，０～２４ｈ控制转速６００ｒ／ｍｉｎ，２４－３０ｈ控制转速５５０ｒ／ｍｉｎ，３０－３６ｈ控制转速５００ｒ／ｍｉｎ，３６－４２ｈ控制转速４５０ｒ／ｍｉｎ，４２ｈ后控制转速４００ｒ／ｍｉｎ，并维持到发酵结束。本发明专利技术提出了一种新的两步法供氧策略（ＮＯＳ）０～２４ｈ，控制转速６００ｒ／ｍｉｎ，然后每６ｈ转速下降５０ｒ／ｍｉｎ直至转速达到４００ｒ／ｍｉｎ，并维持到发酵结束。运用新的供氧策略后，Ｌ－精氨酸的产量比高供氧（ＨＯＳ）和中供氧（ＭＯＳ）分别增加了１６％和５１％，而且，葡萄糖的消耗速率明显增加，发酵周期仅为８１ｈ，比ＨＯＳ条件下提前了６ｈ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及采用两步法供氧策略提高发酵生产L-精氨酸产量的方法，更具 体而言，涉及通过在分批发酵条件下，通过供氧条件的改变，以高产量生产L-精氨酸的方法。属于发酵工程
技术介绍
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重 要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理 和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用 途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。目前发现供氧水平对于发酵法生产L-精氨酸有重要影响。氧气在好氧发酵 生产L-精氨酸过程中，通常既是营养因素，又是环境因素，菌体的新陈代谢与 氧气呼吸密切有关。氧气的供应不足可能会导致微生物细胞代谢转向所不需要 的化合物的产生。目前利用钝齿棒杆菌分批发酵生产L-精氨酸采用的是单一供氧模式，但是， 同一种微生物的需氧量随菌龄和培养条件不同而异，菌体生长和形成代谢产物 时的耗氧量也往往不同。因此，供氧的控制是极其重要的，不仅能合理供氧， 还能为发酵生产节约成本。所以，通过对单一供氧模式下发酵特征差异的研究，提出一个全新的更适 宜于钝齿棒杆菌发酵生产L-精氨酸的供氧模式成为持续的需求。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是建立一个发酵生产L-精氨酸的供氧模式来生产高浓度 的L-精氨酸的方法。本专利技术的技术方案 一种通过两步法供氧策略提高发酵生产L-精氨酸产量 的方法，在钝齿棒杆菌fCwy"ek "en'wm crem^wmJ SYPW发酵生产L-精氨酸 过程中，0 24h控制转速600 r/min， 24-30 h控制转速550 r/min， 30-36 h控制 转速500r/min， 36-42 h控制转速450 r/min， 42 h后控制转速400 r/min，并维持 到发酵结束。钝齿棒杆菌^Cw7"Aacfen'wm cww^wmy* SYPW已在中国专利 (03112896.3)公开。摇瓶培养摇瓶种子培养基以g/L计葡萄糖30，玉米浆20， (NH4)2S04 20，KH2P04 1， MgS04.7H20 0.5，尿素1.5， pH7.0 7.2， 12rC灭菌20min，装 液量30mL/250mL;培养方法斜面活化培养3rC培养20 24h;种子培养 从斜面上挑取一环菌体接入液体种子培养基，31°C，于往复摇床上110r/min，培 养15-16h;发酵罐培养罐上发酵培养基以g/L计葡萄糖150，玉米桨4， (NH4)2S04 20， KH2P04 1.5， MgSO4.7H2O0.5, FeS04.7H20 0.02， MnS04.H20 0.02，生 物素8xl(T5， L-组氨酸5x10-4，氨水控制pH 7.0 7.2， 121匸灭菌10 min;装 液量3L/5L发酵罐；培养方法5L自控发酵罐分批发酵5L发酵罐中装液量 3L，接种量5%， 31°C，通风量3L/min，流加氨水控制pH在6.8，通过豆油消 泡，溶氧自动显示，通过控制所述的搅拌转速来实现供氧差异。本专利技术运用代谢流量分析的手段，分析了钝齿棒杆菌(Too^e^cte^w cre"a&m卩SYPW生物合成L-精氨酸的代谢途径网络，以及不同溶氧水平对 a^v"e&c&n^m cre"a^m SYPW L-精氨酸合成相关代谢流量分布的影响，溶氧 变化决定和控制L-精氨酸整个代谢网络，进而在此基础上提出了合成L-精氨酸 的分阶段供氧控制策略。本专利技术的钝齿棒杆菌分步供氧发酵生产L-精氨酸实验在5L罐上完成，通过 控制不同的搅拌转速来实现供氧差异，在钝齿棒杆菌分批发酵过程中，在线监 测溶氧，离线检测发酵过程中菌体干重、葡萄糖消耗、有机酸(丙酮酸、乳酸、 乙酸)和氨基酸的含量。在已知上述代谢产物的基础上，运用代谢流量分析的手段，对钝齿棒杆菌 代谢网络的流量分布进行分析，探索菌体生长和产酸等发酵特征对供氧的规律 性，进而在此基础上提出新的供氧控制策略，并对该供氧控制策略进行验证和 分析。本专利技术的有益效果本专利技术提出了一种新的两步法供氧策略(NOS)0 24h， 控制转速600r/min，然后每6h转速下降50 r/min直至转速达到400 r/min，并维 持到发酵结束。运用新的供氧策略后，L-精氨酸的产量比高供氧(HOS)和中供氧 (MOS)分别增加了 16%和51%,而且，葡萄糖的消耗速率的明显增加，发酵周 期仅为81h，比HOS条件下提前了 6h。附图说明图1 C. crenatum SYPW合成L-精氨酸的代谢网络模型； 图2溶氧控制模式对L-精氨酸发酵过程的影响；I:A:菌体干重;B:葡萄糖浓度；C: L-精氨酸浓度;D: L-精氨酸合成速率；1:高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS—);3:低供氧LOSO).II:溶氧.l:高供氧HOS;2:中供氧MOS;3:低供氧LOS.图3两步供氧模式与高溶氧(HDO)和中溶氧(MDO)发酵过程比较I: A:菌体干重;B:葡萄糖浓度；C: L-精氮酸浓度;D: L-精氨酸合成速率.溶 氧1:高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS—); 3:两步供氧策略NOS ( )。 II:溶氧l:高供氧HOS;2:中供氧MOS;3:两步供氧策略(NOS)。图4HOS、 MOS和NOS条件下不同发酵阶段，a-KG节点处，TCA循环 Glu/TCA流量分配比(r24/r22)，葡萄糖消耗速率以及ATP生产速率的比较A:TCA流量分配(r22); B: r24/r22比率；C:葡萄糖消耗速率；D: ATP生成速率。1:高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS(隱)；3:两步供氧策略NOS (參)。具体实施例方式实施例l:溶氧控制模式对L-精氨酸发酵过程的影响为了更准确地分析溶氧水平对L-精氨酸发酵的影响，专利技术人将整个发酵过程分为四个阶段，每个阶段都对应于该阶段特有的生理状态。第一个阶段phase I(0~21h)，是从零时刻开始，该阶段营养物质基本全部用于菌体生长，尚无目的 产物L-精氨酸合成；第二个阶段phase H(21 45h)， L-精氨酸的合成速率及葡萄 糖的消耗速率开始增加，菌体生长趋于稳定；第三个阶段phase m(45 69h)，产 物合成速率达到最大后迅速下降，并维持在一稳定速率；第四个阶段phase IV(69 87h)，为衰亡期，菌浓开始下降。供氧方式的改变对C. cww"&mSYPW的生长，葡萄糖的消耗，L-精氨酸的 合成以及各种因素的相互作用都有很大影响。如图2所示，在高供氧(以下简 称HOS)条件下L-精氨酸的产量为31.1g/L，而在中供氧(以下简称MOS)和 低供氧(以下简称LOS)条件下的L-精氨酸产量只分别达到16.0g/L和3g/L。 然而，在42 84h (发酵后期)内，HOS下的L-精氨酸合成速率下降迅速(图 2.I-D)，而MOS下的L-精氨酸合成速率却明显比HOS下稳定。这说明高溶氧 水平并不有利于后期L-精氨酸的合成。另外，菌体干重的最大值也是在MOS 条件下的第二阶段获得，这与通常认为的HOS更有利于菌体生长相悖。葡萄糖 作为发酵生产L-精氨酸的唯一碳源，菌体对葡萄糖的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过两步法供氧策略提高发酵生产Ｌ－精氨酸产量的方法，其特征在于在钝齿棒杆菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ ＳＹＰＷ发酵生产Ｌ－精氨酸过程中，０～２４ｈ控制转速６００ｒ／ｍｉｎ，２４－３０ｈ控制转速５５０ｒ／ｍｉｎ，３０－３６ｈ控制转速５００ｒ／ｍｉｎ，３６－４２ｈ控制转速４５０ｒ／ｍｉｎ，４２ｈ后控制转速４００ｒ／ｍｉｎ，并维持到发酵结束； 摇瓶培养：摇瓶种子培养基以ｇ／Ｌ计：葡萄糖３０，玉米浆２０，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］２０，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．５，尿素１．５，ｐＨ７．０～７．２，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，装液量３０ｍＬ／２５０ｍＬ；培养方法：斜面活化培养：３１℃培养２０～２４ｈ；种子培养：从斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，３１℃，于往复摇床上１１０ｒ／ｍｉｎ，培养１５－１６ｈ； 发酵罐培养：罐上发酵培养基以ｇ／Ｌ计：葡萄糖１５０，玉米浆４，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］２０，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１．５，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．５，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．０２，ＭｎＳＯ↓［４］.Ｈ↓［２］Ｏ０．０２，生物素８×１０↑［－５］，Ｌ－组氨酸５×１０↑［－４］，氨水控制ｐＨ７．０～７．２，１２１℃灭菌１０ｍｉｎ；装液量３Ｌ／５Ｌ发酵罐；培养方法：５Ｌ自控发酵罐分批发酵：５Ｌ发酵罐中装液量３Ｌ，接种量５％，３１℃，通风量３Ｌ／ｍｉｎ，流加氨水控制ｐＨ在６．８，通过豆油消泡，溶氧自动显示，通过控制所述的搅拌转速来实现供氧差异。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，饶志明，许虹，张晓梅，许泓瑜，窦文芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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