利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供一株提高１，３－丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）ｐＥＴＰｋａｎ－ｄｈａＴ，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０８１３４。将来自克雷伯氏杆菌１，３－丙二醇氧化还原酶的基因ｄｈａＴ，构建克雷伯氏杆菌表达载体ｐＥＴＰｋａｎ－ｄｈａＴ；将该表达载体转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌ｐＥＴＰｋａｎ－ｄｈａＴ；加强ｄｈａＴ基因的表达，得到的重组克雷伯氏菌在以甘油为底物的发酵过程中，中间产物３－羟基丙醛积累量明显降低，１，３－丙二醇产量比对照提高１６．９％；为构建高产１，３－丙二醇或利用葡萄糖为底物产１，３－丙二醇克雷伯氏基因工程菌打下基础。
【技术实现步骤摘要】
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，涉及卡那霉素抗性基因启动子在提高克雷伯氏菌1，3-丙二醇产量中的应用，属于基因工程
技术介绍
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol, 1，3-PD)是一种重要的化工原料，作为医药和 有机合成的中间体用于食品、化妆品和制药等行业，1,3-丙二醇最重要的用途就 是作为合成新型聚酯如聚对苯二甲酸-l，3-丙二醇酯(PTT)的单体，因而1,3-PD 在纺织、地毯以及工程塑料领域也具有非常广阔的应用前景。1,3-丙二醇生产主 要采用化学方法，但因环境污染、石油资源紧张等，使其进一步发展受到限制。 欧美国家积极开展用肠道细菌和梭状芽孢将甘油转化为1，3-PD的研究，Dupont 公司开发的由葡萄糖合成1，3-PD，进而合成PTT的工艺，被授予2003年美国总 统绿色化学奖。目前，应用自然菌株发酵生产l，3-丙二醇得到了广泛的关注，其能以甘油作 为唯一的碳源和能源发酵生产1，3-PD。自然菌株主要集中在克雷伯氏杆菌属、 弗氏柠檬杆菌属和梭状芽孢杆菌属。人们对克雷伯氏菌研究较早，对其代谢途 径认识比较清楚，有研究表明，克雷伯氏菌以甘油为底物生产1,3-PD，经过以 下两步反应，即甘油在甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成中间产物3-羟基丙醛； 3-羟基丙醛在1,3-丙二醇氧化还原酶(PD0R)的催化下生成1，3-PD。从目前研究的现状看，克雷伯氏杆菌(《/AwW/a.^发酵甘油的底物转化率、 产物浓度和生产强度都比较高，因此是一种有希望实现工业化的方法。然而相 比化学法合成1,3-PD的价格，微生物发酵法目前没有明显的成本优势，其主要 的原因是发酵液中产品的浓度和发酵强度低，从而使生产成本相对较高，为取 得更大的经济效益尚存障碍，因此，为进一步降低生产成本，开发提高1，3-PD 发酵液中产品浓度及生产强度的克雷伯氏基因工程菌成为研究的重点。如利用 分子生物学技术将甘油合成1，3-PD关键酶基因转入克雷伯氏菌内，增强甘油合 成1,3-PD代谢流通量，从而提高克雷伯氏菌的生产强度；或将葡萄糖合成甘油 关键酶基因导入克雷伯氏菌中，扩大克雷伯氏菌的底物利用范围，即能以廉价 的碳水化合物如葡萄糖为底物直接生产1，3-PD，以降低生产成本，提高产品的 竞争力。然而，构建一种高效的表达系统是利用途径工程改造克雷伯氏菌的前提和基础。本专利技术将利用分子生物学技术构建了一种新型表达载体，该载体能在克 雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷 伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯氏基因工程菌打下坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种新型的表达载体为进一步对克雷伯氏菌进行改造 奠定基础。本专利技术的新型表达载体能在克雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表 达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯 氏基因工程菌打下坚实的基础。本专利技术的技术方案 一株提高l,3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类 命名为克雷伯氏杆菌(A7A^//asp.) pETPkarwZ/z"T，已保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: M208134。所述的重组克雷伯氏杆菌，其构建所用的表达载体pETPkan-^aT，采用卡 那霉素抗性基因启动子尸b"。所述的重组克雷伯氏杆菌，其扩增了来自克雷伯氏杆菌l， 3-丙二醇氧化还 原酶的基因WaT。所述的重组克雷伯氏杆菌，达到克雷伯氏杆菌自身的1， 3-丙二醇氧化还原 酶加强表达，来提高发酵法生产l， 3-丙二醇的产量。所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，将来自克雷伯氏杆菌l， 3-丙二醇氧化 还原酶的基因WaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan-W"T;将该表达载体 pETPkarwZ/7aT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌(iC/e6wW/a sp.) pETPkan-^aT;(1)质粒pETPkan的构建以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下 P1: 5 ，-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3' P2: 5 ，-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3' PCR方法如下50|iL反应体系中加入1Ommol/L的引物Pl和P2各1.5^iL， 2mmol/L的dNTP 5pL， 10xExTaq Buffer 5fiL， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5|iL， 模板1吗，加双蒸水补齐50pL; PCR条件为95。C变性5分钟；94。C变性l分 钟、54TM分钟、72'C延伸2分钟，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR 片段回收试剂盒回收0.5 kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bg/ II和五coR I 双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pET28a经过^w H I和￡coR I双 酶切，用PCR片段胶回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段， 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50 pg/mL卡那 霉素的LB琼脂平板，37"C培养过夜；提取质粒，分别用Bg/II和&oRI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20%甘油的LB中，冷 冻保存于-80。C;重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan;(2) 质粒pETPkan-CMcds的构建以质粒pACYCDuet为模板进行PCR扩增氯霉素编码结构基因CMcds，所 用引物如下P3: 5 ，-cgc gaa ttc ATG GAG AAA AAA ATC ACT GG-3' P4: 5 ，-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3'PCR方法如下50pL反应体系中加入10mmol/L的引物P3和P4各1.5pL， 2mmol/L的dNTP 5pL， 10xExTaq Buffer 5pL， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5pL， 模板1吗，加双蒸水补齐50pL; PCR条件为95。C变性5分钟；94。C变性l分 钟、54'C1分钟、72'C延伸2分钟，循环35次；用试剂盒回收0.7 kb的目标片段；纯化好的目标片段经I和///"d III 双酶切，回收；同时提取质粒pETPkan，并用五coR I和历"d III双酶切，回收 纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感 受态细胞，转化物涂布于含有50 pg/mL卡那霉素和25 |_ig/mL氯霉素的LB琼 脂平板，37"C培养过夜；提取质粒，分别用五coR I和/Z/mi ni双酶切，琼脂糖 凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20X甘油的LB中，冷冻保存 于-80°C ; 重组质粒命名为pETPkan-CMcds ，阳性重组子命名为 JM109/pETPkan-CMcds 。(3) 质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌质粒pETPkan-CMcds用氯化钙法转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株提高１，３－丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）ｐＥＴＰｋａｎ－ｄｈａＴ，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０８１３４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，马正，杨套伟，诸葛斌，方慧英，诸葛健，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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