一种产白僵菌素的盾叶薯蓣内生镰孢菌及其抗细菌活性制造技术

本发明专利技术涉及一种产白僵菌素的盾叶薯蓣内生镰孢菌。本发明专利技术所述的内生真菌Ｄｚｆ２是从盾叶薯蓣中采用内生真菌分离技术分离获得的，经微生物分类鉴定为镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｓｐ．），该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．２３４０。本发明专利技术首次从盾叶薯蓣中分离出产白僵菌素的内生真菌，并明确了白僵菌素的抗菌活性。目的是利用植物内生真菌资源，获得天然活性成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，特别是涉及一种其代谢产物为白僵菌素的微生物一盾叶薯蓣内生镰孢菌o
技术介绍
植物内生真菌(plantendophyticfongi)是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物 组织或器官内部，宿主植物不表现外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生生 物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类等多种结构类型的代谢产物，具有抗 菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独 特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、工业、食品等领域具有重要的应 用前景。白僵菌素(beauvericin)是一种具有抗菌、杀虫、抗癌、抑制胆甾醇酰基转移酶活性、引发细胞程序 性凋亡等生物活性的脂肽类化合物，最早在真菌球孢白僵菌(5eam^^6aw/朋a)中发现。白僵菌素具有 环状的化学结构，由3个2-羟基异戊酸和3个N+甲基苯丙氨酸通过肽键和酯键交错相连而成，分子式为 C45H57N309，分子量为783.4。白僵菌素的活性研究集中在杀虫活性上，对微生物抑制活性的报道较少。盾叶薯蓣(Dioscoreazi'"g沾erensfsC.H. Wright)在分类上属于单子叶百合目薯蓣科(Dioscoreaceae)， 为我国特有的药用植物，分布于湖南、湖北、四川、甘肃等省区，其根状茎多年生长在地下，对土传病原 菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生菌有关。目前尚未见从盾叶薯蕷内生真菌中分离纯化单一化合物的报道。本专利技术着重于内生真菌提取物抗菌活 性的研究，为探讨内生真菌的生理生态功能(如提髙宿主的抗病性等)提供依据。本专利技术的目的是提供一种经发酵培养能产生白僵菌素成分的微生物，即盾叶薯蓣内生镰孢菌。
技术实现思路
本专利技术涉及一种镰孢菌(尸uwwv'wmsp.)，菌株代号为DzC,现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏日期为2008年1月16日，登记入册编号为2340。本专利技术提供如下的技术方法。1、 内生镰孢菌DzC的分离釆集新鲜的盾叶薯蕷根状茎，釆用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Dzf2。2、 内生镰孢菌Drf2的形态特征(l)无性世代菌株Dzf2在PDA培养基上25。C培养，产生大量的气生菌丝，白色，边缘菌丝稀疏， 菌落背面桔黄色，分生孢子梗单生或轮生，瓶梗状，基部有分隔，大孢子近镰刀形，2-3个隔，小孢子卵 圆形，椭圆形，肾形无隔或者l个隔，孢子大小4.3-24fimx2.4-5拜。内生真菌Dzf2的形态特征(见图l、图2、图3和图4)符合镰孢菌属(Fww'鹏)真菌的形态特征。 (2)有性世代未发现。3、 内生镰孢菌Drf2的分子生物学特征运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')禾B ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3')。将Dzf2菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列 号(accessionnumber) DQ4462U。同时将Dzf2菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比 对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Dzf2菌株的ITS序列与芬芳镰孢菌(Fusan'wm mto/ens)X94169 的ITS序列相似度为99.5%,其同源性的系统发育树图见图5。4、 内生镰孢菌Dzf2的发酵培养特征 培养基液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。 培养温度25±1°C。发酵时间7天。 摇床转速120rpm。发酵培养特征培养第2天，菌液无色；培养第5天，菌液略带橙黄色；培养第7天，菌液为灰黑色。5、 内生镰孢菌Drf2粗提物的抗菌活性采用琼脂打孔药剂扩散法，内生真菌Dzf2菌液和菌丝提取物均表现出一定的抗菌活性，菌液提取物 的活性强于菌丝提取物。采用多孔板液体稀释法，噻唑蓝(MTT)为显色剂，测定了内生真菌Dzf2菌液 和菌丝提取物的最低抑菌浓度(MIC),菌液提取物对大肠杆菌、番茄细菌斑点病菌、枯草芽孢杆菌和溶血 葡萄球菌的MIC值分别为0.03125 mg/ml、 0.0625 mg/ml、 0.0625 mg/ml和0.125 mg/ml。6、 白僵菌素的追踪分离特征通过薄层层析-生物自显影抗菌活性检测，对内生真菌Dzf2培养物的提取物进行反复的柱层析，包括 常规的硅胶柱层析、S印hadexLH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析，分离到一纯的抗菌化合物，该化合 物为白色针状晶体。7、 白僵菌素的结构特征白僵菌素为一具有环状化学结构的脂肽类化合物，由3个2-羟基异戊酸和3个N-甲基苯丙氨酸通过肽 键和酯键交错相连而成，分子式为C4SH57N309,分子量为783.4。8、 白僵菌素的抗菌活性特征采用多孔板-MTT比色法测定白傻菌素对4种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑 病菌、番茄细菌斑点病菌)和两种革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌)的抑制活性。白便菌 素对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌、枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌的半抑 制浓度(IC5o)分别为55.59^ig/ml、 21.23jig/ml、 70.71pg/ml、 18.97ng/ml、 18.45pg/ml、 26.57fig/ml，而阳性对照硫酸链霉素对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌、枯草芽孢杆菌、溶血 葡萄球菌的半抑制浓度分别为18.75ng/ml、 21.23ng/ml、 17.51ng/ml、 18.97fig/ml、 12.05ng/ml、 36.76ng/ml。其中白僵菌素对溶血葡萄球菌的抑制活性要强于硫酸链霉素，对根癌土壤杆菌和番茄细菌斑点病菌的抑制 活性与硫酸链霉素相当。附图说明图1为内生真菌Dzf2菌落正面。图2为内生真菌Dzf2菌落背面。图3为内生真菌Dzf2的菌丝、分生孢子梗、分生孢子。图4为内生真菌Dzf2的分生孢子。图5为内生真菌Dzf2同源性的系统发育树图。图6为内生真菌Dzf2提取物和已分离纯化的白僵菌素薄层层析-生物自显影检测结果。本专利技术的优点本专利技术首次明确了具有广谱抗菌活性的内生镰孢菌Dzf2菌株的微生物学分类地位， 同时发现该菌提取物对大肠杆菌、番茄细菌斑点病菌、枯草芽孢杆菌和溶血葡萄球菌的生长具有明显的抑 制作用。采用活性追踪的分离方法，从Dzf2菌株中分离到具有明显抗菌活性的化合物白僵菌素。目的是 利用植物内生真菌资源，以求获得天然抗生素类成分，为探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。为了更好地理解本专利技术，下面结合本专利技术的实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容 并不局限于此。具体实施方式实施例l:内生真菌Drf2的分离采集新鲜的盾叶薯蓣根状茎，表面先用70%乙醇处理303，然后用0.2。/。氯化汞处理20min以进行彻底 的表面灭菌，无菌条件下去除表皮，将根状茎分成约0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的块段，摆放在PDA培养 基上，每皿1块，在25""C,光照条件下培养至第7^20天，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产白僵菌素的盾叶薯蓣内生真菌，其特征是命名为镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２３４０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周立刚，姜微波，彭友良，王明安，徐利剑，黄永富，赵江林，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[]