微杆菌及诱变方法与其在手性药物中间体生产上的应用属于微杆菌领域。本发明专利技术采用本实验室筛选并保藏的氧化烃微杆菌（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ）（Ｌ２９－９）保藏号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０８５为亲株，按常规方法进行物理化学逐级诱变处理，并经筛选，得到突变株Ｌ２９－９－Ｂ－４保藏号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５０；在优化条件下提高其生产内酰胺酶的活力，酶活提高了十一倍，通过生物转化消旋２－氮杂双环－［２．２．１］－庚烷－５－烯－３－酮得到（１Ｒ，４Ｓ）－２－氮杂双环－［２．２．１］－庚烷－５－烯－３－酮及（１Ｓ，４Ｒ）－２－氮杂双环－［２．２．１］－庚烷－５－烯－３－酮。这样对于生物转化生产手性药物中间体（１Ｒ，４Ｓ）－２－氮杂双环－［２．２．１］－庚烷－５－烯－３－酮时，可以提高γ－内酰胺的浓度或者缩短转化时间，从而提高转化效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种氧化烃微杆菌及诱变方法及应用其突变株生产手性药物中间体(1R，4S》2-氮杂双环--庚垸-5-烯-3-酮的方法。
技术介绍
(1R,4S)- 2-氮杂双环--庚垸-5-烯-3-酮是一种十分有用的药物中间 体，它有两种异构体即(1R，4S)构型和(1S，4R)构型。阿巴卡韦及卡波韦等许多 碳环嘌呤和嘧啶核苷酸类似物具有抗HIV效果，(1R，4S)构型的化合物是合 成以上药物的原料。对可以立体选择性水解消旋2-氮杂双环--庚烷-5-烯-3-酮而得到其(lR,4S)构型化合物的产酶菌株进行诱变育种，得到高产菌株， 可以降低上述药物的原料成本。在制药行业有实际应用价值，特别对抗艾滋 病药物的合成具有重要意义。从工业化角度看，要求立体选择性水解消旋2-氮杂双环--庚垸-5-烯-3-酮而得到其(lR，4S)构型化合物的产酶菌株遗传稳定性好，工艺放大容易， 这样才能适合工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以立体选择性水解消旋2-氮杂双 环--庚烷-5-烯-3-酮而得到其(lR,4S)构型化合物的产酶菌株的 诱变方法与利用其突变株生产手性药物中间体(1R，4S)- 2-氮杂双环 --庚烷-5-烯-3-酮的方法。 本专利技术用于转化生产(-)，内酰胺的微生物是一种氧化烃微杆菌(MifcraZ)actenY/w/y^racwZ)0"0;9^/"ra) (L29-9-B-4)，保藏号为CGMCC No.2350，保藏日为2008年1月21日。该菌株具有如下的性质形态生理生化特征 形态特征杆菌，菌落呈浅黄色，湿润，粘稠，圆形，边缘 整齐，不透明。生理生化特征革兰氏阳性细菌，产Y-内酰胺水解酶。本专利技术所述的该菌株的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤(1)培养出发菌株出发菌株为氧化烃微杆菌(是'crote"eri鹏 力j^roca^ 朋out/朋s) (L29-9)，保藏号为CGMCC No. 2085 ;所述出发菌株的培养参见专利申请"一种微杆菌以及采用该菌种转化生 产手性药物中间体的方法"，申请号200710118064.1，申请日2007-6-28; 在此不再赘述；(2) 上述出发菌株经紫外、紫外和LiCl复合诱变、硫酸二乙酯、亚硝 基胍逐级诱变紫外线诱变条件15w， 254nm紫外灯20cm处照射90s，避光培养，筛 选得诱变菌株L29-9-A;紫外线、LiCl复合诱变条件LiCl浓度为1.5%， 15w， 254nm紫外灯20cm 处照射90s，避光培养，筛选得诱变菌株L29-9-A-2;硫酸二乙酯诱变条件硫酸二乙酯浓度为1.5%，震荡处理50min，筛选 得诱变菌株L29-9-B;亚硝基胍诱变条件0.8mg/mL亚硝基胍处理30min，筛选得诱变菌株 L29-9-B-4;(3) 培养和筛选3. 1平板筛选培养 平板筛选培养温度为25 4(TC，培养1 5天； 平板筛选培养基Na2HPO4'12H2O0.7%; KH2PO40.2%;MgSO4.7H2O0.02%; CaCl2'2H20 0.001%; FeS04'7H20 0.0007%;ZnS04 0.000001%; NH4C10.2%; N-乙酰苯丙氨酸0.5%;琼脂粉2%以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min;3.2初筛随机挑取平板筛选培养基上长势良好的单菌落于斜面保存培养基上，25 4(TC培养25 50小时后，接入种子培养基中25 4(TC条件下，摇床振荡 培养20 50小时；离心、洗涤并转化Y-内酰胺，用手性HPLC法测定ee值， 保存ee值高于90%的菌株进行复筛； 3.2复筛挑取初筛得到的菌株接入种子培养基中25 4(TC条件下，摇床振荡培养 20 50小时，制得种子；以5%体积/体积百分比接种量，接种子于液体发酵 培养基中，制得发酵液，离心、洗涤并转化Y-内酰胺，用HPLC法测定酶活， 保存酶活最高的菌株；其中液体发酵培养时装液量为40ml/250ml三角瓶，培养温度为25 40°C 有氧条件下，摇床振荡培养20 50小时，摇瓶转速为100 300转/分；种子培养基Na2HPO4'12H2O0.7%; KH2P04 0.2%; MgS04'7H20 0.02%; CaCl2'2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氮酸0.3%;碳源0.5%; 氮源0.5%，以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值 为7.0， 105kPa灭菌30min;液体发酵培养基Na2HPO4'12H2O0.7%; KH2P04 0.2%;MgS04'7H20 0.02o/o; CaC12'2H20 0.0010/0; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0.4%;碳源0.6%;氮源0.5%，以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min。上述微杆菌在手性药物中间体生产上的应用，其特征在于，包括以下步骤(1) 菌种选择选用经过逐级诱变的氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)的突变株L29-9-B-4;(2) 种子培养将突变株L29-9-B-4无菌条件下用接种环接于种子培养 基中，25 5(TC条件下，摇床振荡培养25 50小时，制得种子；其中种子培 养基组成为Na2HPO4.12H2O0.70/0; KH2PO4 0.2%; MgS04.7H20 0.02%; CaC12.2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N画乙酰苯丙氨酸0.3%;碳源 0.5%;氮源0.5% (均为质量/体积百分比)，溶于去离子水，以碱性物质调 pH值为7.0， 105kPa灭菌30min;(3) 摇瓶培养以5%体积/体积百分比接种量，接种子于液体发酵培养基中，25 5(TC有氧条件下，摇床振荡培养20 50小时，制得发酵液；其中 液体发酵培养基组成为Na2HP04'12H20 0.7%; KH2P04 0.2%; MgSO小7H20 0.02%; CaC12.2H20 0.001%; FeS04.7H20 0.0008%; N-乙酰苯丙氨酸0.4%;碳源0.6%;氮源0.5%，以上均为质量/体积百分比，溶于去离子水，以碱性物质调pH值为7.0， 105kPa灭菌30min;(4) 收集菌体取步骤(3)的发酵液10000转/分钟条件下离心3分钟， 收集沉淀菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤，得到湿菌体作为生物催化剂;(5) 生物转化实验将步骤(4)中的生物催化剂湿菌体与2 20g/L 内酰胺溶液混合；湿菌体浓度为0.1%质量/体积百分比；在25 50°C, pH6.0 8.0条件下，200 220转/分钟振荡1 12小时；(6) 分离样品以10000转/分钟离心5分钟，分离步骤(5)中生物催 化剂，得到上清液即为样品。进一步的，步骤(3)的培养温度为25 40。C。 进一步的，磷酸盐缓冲液为0.05MNa2HP04: 0.05MNaH2P04体积比为 7: 3。进一步的，所述的碱性物质包括NaOH、 KOH、氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微杆菌Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ Ｌ２９－９－Ｂ－４，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３５０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑国钧，冯亮，王建军，林建东，郭晓燕，曹燕萍，赵一飞，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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