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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶催化,尤其涉及一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用。
技术介绍
1、甘油葡萄糖苷(glucosyl glycerol,gg)是一种由葡萄糖基和甘油通过糖苷键连接形成的糖苷类化合物,可以保护细胞免受高渗透压、高温、干旱以及紫外线等恶劣环境的破坏。2-o-α-甘油葡萄糖苷(2-o-α-gg)是gg的异构体之一,不仅具有优异的保湿性能,其甜度仅为蔗糖的55%。更重要的是,由于2-o-α-gg存在时人唾液中的口腔细菌因不会产生酸而表现出非致龋性,可作为潜在甜味剂应用于食品工业。同时,2-o-α-gg具有低吸水性、高保湿性的特点,可作为多用途的抗衰老、促细胞和皮肤保湿剂应用于化妆品行业,具有广阔的市场前景和需求。
2、相比较产率太低、副产物多的化学法,酶催化法合成2-o-α-gg具有反应速率快、底物特异性较强、反应条件温和且环保的优点。蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,spase)是一种能够特异性转移葡萄糖苷键的酶,目前主要用于2-o-α-gg合成的生物催化剂,具有良好的特异性。然而,野生蔗糖磷酸化酶耐热性较差,受热易降解,难以满足工业催化过程中,需要通过高温提高反应速率、反应物的溶解度和减少微生物污染的要求,限制了其在大规模工业加工中的应用。
3、目前,酶的稳定性改造基本集中在定点诱变和合理设计方面,然而,当突变位点位于活性位点附近时,平衡酶的活性和耐热性是极具挑战性的。同时,合理的设计需要大量的迭代实验,这对于一些缺乏高通量筛选方法的酶来说是极其困难的。因此,需要开发一种无需广泛
4、与常规线性蛋白质相比,环状蛋白质具有更高的热稳定性和结构稳定性。因此,选择一种合适的分子环化技术将spase线性酶转变为环化酶有望提高spase的热稳定性。spytag/spycatcher是一对反应速率快、反应过程无需特定催化酶、适用对象广的分子粘合剂,能够通过异肽键实现连接。因此,基于spytag/spycatcher等分子粘合剂实现spase自环化,有望提升spase的耐热性和2-o-α-gg的产率,实现2-o-α-gg大规模酶法制备,具有极高的工业利用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种环化蔗糖磷酸化酶及其应用,为2-o-α-gg的大规模酶法制备提供新的可行性。
2、为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:
3、本专利技术提供了一种环化蔗糖磷酸化酶,所述环化蔗糖磷酸化酶是通过下述linker1~8中的任意一种将如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键得到的;
4、linker 1:gsg;
5、linker 2:gsgsgsgsg;
6、linker 3:gsgsgsgsgsgs;
7、linker4:gslvprgsc;
8、linker 5:eaaakeaaak;
9、linker 6:gggggs;
10、linker 7:sssssg;
11、linker 8:ggggssss。
12、优选的,所述异肽键包括由如seq id no.2所示的spytag与如seq id no.3所示的spycatcher构成的异肽键、由如seq id no.4所示的snooptag与如seq id no.5所示的snoopcatcher构成的异肽键或由如seq id no.6所示的sdytag与如seq id no.7所示的sdycatcher构成的异肽键。
13、优选的,所述环化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.8~seq id no.17所示。
14、本专利技术提供了编码所述环化蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列。
15、本专利技术提供了包含所述核苷酸序列的表达载体。
16、本专利技术提供了包含所述表达载体的宿主细胞。
17、本专利技术还提供了所述的环化蔗糖磷酸化酶,或所述的核苷酸序列,或所述的表达载体,或所述的宿主细胞在生产2-o-α甘油葡萄糖苷中的应用。
18、本专利技术还进一步提供了一种生产2-o-α甘油葡萄糖苷的方法,包括如下步骤:
19、(1)培养所述的宿主细胞,然后破碎得到含有环化蔗糖磷酸化酶的酶液;
20、(2)将蔗糖、甘油溶于水后与所述含有环化蔗糖磷酸化酶的酶液混合,在30~50℃,ph 5.5~8.0条件下反应12~48h后得到2-o-α甘油葡萄糖苷。
21、优选的,蔗糖溶于水后的浓度为0.25~1.5mol/l,甘油溶于水后的浓度为0.3~1.6mol/l。
22、优选的,所述酶液中环化蔗糖磷酸化酶的终浓度为0.5~2mg/ml。
23、本专利技术通过linker在野生蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键,制备得到了一种酶活显著提高的环化蔗糖磷酸化酶,可在24h内将蔗糖快速转化,其在具有较高的催化活性的同时,还具有良好的温度稳定性,更适用于工业化生产,为2-o-α-gg大规模酶法制备提供了新的可行性。
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1.一种环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述环化蔗糖磷酸化酶是通过下述linker 1~8中的任意一种将如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的N端和C端分别连接上不同的异肽键得到的;
2.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述异肽键包括由如SEQ IDNO.2所示的SpyTag与如SEQ ID NO.3所示的SpyCatcher构成的异肽键、由如SEQ ID NO.4所示的SnoopTag与如SEQ ID NO.5所示的SnoopCatcher构成的异肽键或由如SEQ ID NO.6所示的SdyTag与如SEQ ID NO.7所示的SdyCatcher构成的异肽键。
3.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述环化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.17所示。
4.编码权利要求1~3任一项所述环化蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列。
5.包含权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。
6.包含权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1~3任一项所述的环化
8.一种生产2-O-α甘油葡萄糖苷的方法,其特征在于,包括如下步骤:
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,蔗糖溶于水后的浓度为0.25~1.5mol/L,甘油溶于水后的浓度为0.3~1.6mol/L。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述酶液中环化蔗糖磷酸化酶的终浓度为0.5~2mg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述环化蔗糖磷酸化酶是通过下述linker 1~8中的任意一种将如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶的n端和c端分别连接上不同的异肽键得到的;
2.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述异肽键包括由如seq idno.2所示的spytag与如seq id no.3所示的spycatcher构成的异肽键、由如seq id no.4所示的snooptag与如seq id no.5所示的snoopcatcher构成的异肽键或由如seq id no.6所示的sdytag与如seq id no.7所示的sdycatcher构成的异肽键。
3.如权利要求1所述的环化蔗糖磷酸化酶,其特征在于,所述环化蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.8~seq id...
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