本发明专利技术公开了用于木薯固氮的微杆菌及其制备方法及应用，其为微杆菌属(Microbacterium sp.)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日：2016年03月07日，保藏编号：CGMCC No.12182；以该微杆菌为活性成分的生物菌剂，将其经管种培养、液体发酵培养后制成的生物菌剂。应用该菌种及其生物菌剂可以显著提高木薯幼苗根、茎、叶的含氮量，有助于木薯生长前期的氮素积累，在木薯的生产上具有较好的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
中的固氮菌领域，特别涉及一种用于木薯固氮的微杆菌及其制备方法及应用。
技术介绍
植物内生固氮菌是指定殖于植物体内，可与宿主植物进行联合固氮的一类微生物。利用内生固氮菌可将大气中游离态的氮元素转变成植物可直接吸收利用的氮素，再进一步转变成植物所需的蛋白质、核酸等大分子物质，供给植物生长所需。从农业上看，利用生物固氮是为作物提供氮肥的重要途径之一。20世纪80年代以来，内生固氮菌由于在禾本科作物上具有固氮活性，又能促进植物生长，成为国内外研究的热点。联合固氮的机制：自从1972年，巴西的科学家在研究禾本科植物时发现了内生固氮菌，引起广泛关注，并在1974年研究牧草和固氮螺菌(Azospirillum)形成的固氮系统中,认为固氮菌株可以侵入宿主器官的皮层组织或维管内，但并不形成共生组织,它们与寄主细胞处于一种“松散”的共生状态,称为“联合共生固氮作用”(associative symbiotic nitrogen fixation)。联合固氮菌促进植物生长的机理主要有两个方面，其中是通过生物固氮为植物提供氮素或产生植物激素直接促进植物生长，其二是通过诱导植物产生植物激素、改
善植物对矿质元素的吸收和利用来间接促进植物生长，促进根系发育。近年来，国内外的研究者先后从甘蔗、水稻、黑麦草等禾本科植物中分离到多种内生固氮菌，此外，还从棕榈树、果树、咖啡树、黑松等林本中也发现了内生固氮菌。近年来的文献报道的内生固氮菌有：固氮醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、塞鲁普卡草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)及固氮弧菌(Azoarus)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、固氮螺菌(Azospirillum)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌(Enterobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮根瘤菌(Azorhizobium)等属中的一些种。在玉米、水稻、小麦田间接种联合固氮菌的实验结果表明，使用相应的根际联合固氮菌剂可增产10％左右。但到目前为止，在木薯中尚未发现有关内生固氮菌的报道。氮肥的施用，对现代农业的发展起着不可替代的作用。我国的氮肥生产量和消费量均居世界首位。但是我国农业对氮肥的过量依赖必然造成报酬递减和环境污染的风险，如土壤的酸化、盐渍化、水体富营养化以及全球温室效应等。相比于化学施氮，生物固氮具有经济和环保等优点，不仅降低农业成本，而且避免了化学施氮所带来的种种环境问题。内生固氮菌在浸染木薯后可与木薯联合固氮，促进木薯生长，减少氮肥使用。分离和筛选以木薯为宿主的内生固氮菌，并应用其促进木薯生长是本专利技术的目的。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的第一目的在于提供一
种用于木薯固氮的微杆菌，第二目的在于提供以所述菌株作为活性成分的生物菌剂及其制备方法，第三目的在于提供所述菌株及其生物菌剂的应用。一种用于木薯固氮的微杆菌的制备方法，步骤为：步骤一、样品选取：对木薯进行采样，选取木薯的根部未膨大的部分，选取一定长度的完整根部，直径为2-3mm；步骤二、将采集的木薯根部按照根长分类，大致分为4类分别为5cm，10cm，15cm，20cm，用蒸馏水冲洗干净；将分类好的木薯根进行表面杀菌，将表面杀菌完成的木薯根用无菌水冲洗5遍，将最后一遍冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，37℃培养36h，确定无菌水涂布的培养基上无菌体生长，证明根部外表面已充分灭菌干净不存在外源菌体，再将根部材料用于内生菌的筛选；步骤三、将步骤二处理后消毒并冲洗干净的根放入研钵中研磨，加入10mL的无菌水后静置5min，取0.1mL的研磨液涂布在无氮固体培养基上，28℃培养5-7d；观察无氮固体培养基上的细菌生长状况，选取能够生长的并能够挑起的单个菌落进行划线培养；在无氮固体培养基上进行划线培养，传代三次后选取能够传代培养，并且可以划线分离的细菌进行后续试验；步骤四、对所得内生固氮菌株进行总DNA提取，并以总DNA为模板，扩增16S rRNA基因序列，扩增产物测序后，结果在NCBI上进行比对。进一步的，所述步骤一中，采样选取苗期木薯。进一步的，所述步骤一中，选取木薯根部的长度在5cm以上。进一步的，所述步骤三中，无氮固体培养基的组成为：蔗糖10g，K2HPO4·H2O 0.1g，MgSO4·H2O 0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，Na2MoO4·H2O 0.002g，Malic acid 5.0g，KH2PO4·H2O 0.4g，NaCl 0.1g，FeCl3 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.0。由上述的微杆菌制得的木薯固氮生物菌剂，该生物菌剂由所述微杆菌经管种培养或液体发酵培养后制得；生物菌剂中的细菌浓度为：每mL活菌数≧108。进一步的，所述的生物菌剂的制备方法，分别为：A、管种培养：将菌株接种到试管斜面培养基上，在温度28-32℃下恒温培养2-3天，即可得到；B：液体发酵：将试管种接种到液体培养基上，28-32℃摇床培养1-2天，即可得到目标菌种为活性成分的生物菌剂。进一步的，A管种培养中所述的试管斜面培养基的成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，pH7.0-7.2；B液体发酵中所述的液体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。用于木薯固氮的微杆菌及其生物菌剂在提高木薯苗期氮素积累中的应用。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术所得到的菌株及其研制的生物菌剂可以有效的提高木薯苗期氮素的积累。固氮酶活性为37.77nmol·mL-1·h-1。附图说明图1为本专利技术菌株在无氮培养基上生长图。图2为本专利技术菌株革兰氏染色图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步详细描述：试验例：从木薯中分离到的1株内生固氮菌A08菌株，属于厚壁菌门(Firmicutes；)微杆菌属(Microbacterium sp.)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日：2016年03月07日，保藏编号：12182；所述从木薯中分离到的内生固氮菌的制备方法包括如下步骤：A.分离培养基：Dobereiner无氮培养基：蔗糖10g，K2HPO4·H2O 0.1g，MgSO4·H2O 0.2g，CaCl2·H2O 0.02g，Na2MoO4·H2O 0.002g，Malic acid 5.0g，KH2PO4·H2O 0.4g，NaCl 0.1g，FeCl3 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.0。B.培养方法：(1)样品选取：在木薯的苗期进行采样，选取木薯的根部未膨大的部分，尽量选取完整的根部，长度在5cm以上，直径为2-3mm左右。(2)具体步骤：将采集的木薯根部按照根长分类，大致分为4类分别为5cm、10cm、15cm和20cm，用蒸馏水冲洗干净。将分类好的木薯根进行表面杀菌，具体杀菌时间处理及结果见表1。将表面杀菌完成的木薯根用无菌水冲洗5遍，将最后一遍冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，37本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于木薯固氮的微杆菌，其特征在于，其为厚壁菌门Firmicutes；微杆菌属Microbacterium sp.，保藏编号为：CGMCC No.12182。
【技术特征摘要】
1.一种用于木薯固氮的微杆菌，其特征在于，其为厚壁菌门Firmicutes；微杆菌属Microbacterium sp.，保藏编号为：CGMCC No.12182。2.根据权利要求1所述的一种用于木薯固氮的微杆菌，其特征在于，所述微杆菌在LB培养基上呈黄色，圆形，表面湿润凸起，边缘整齐，易挑起；革兰氏阳性菌株，其吲哚实验、二乙酰试验、葡萄糖发酵均为阳性，甲基红、淀粉水解实验、明胶液化实验、柠檬酸盐实验、乳糖发酵、蔗糖发酵、麦芽糖发酵均为阴性。3.一种用于木薯固氮的微杆菌的制备方法，其特征在于，步骤为：步骤一、样品选取：对木薯进行采样，选取木薯的根部未膨大的部分，选取一定长度的完整根部，直径为2-3mm；步骤二、将采集的木薯根部按照根长分类，大致分为4类分别为5cm，10cm，15cm，20cm，用蒸馏水冲洗干净；将分类好的木薯根进行表面杀菌，将表面杀菌完成的木薯根用无菌水冲洗5遍，将最后一遍冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，37℃培养36h，确定无菌水涂布的培养基上无菌体生长，证明根部外表面已充分灭菌干净不存在外源菌体，再将根部材料用于内生菌的筛选；步骤三，将步骤二处理后消毒并冲洗干净的根放入研钵中研磨，加入10mL的无菌水后静置5min，取0.1mL的研磨液涂布在无氮固体培养基上，28℃培养5-7d；观察无氮固体培养基上的细菌生长状况，选取能够生长的并能够挑起的单个菌落进行划线培养；在无氮固体培
\t养基上进行划线培养，传代三次后选取能够传代培养，并且可以划线分离的细菌进行后续试验；步骤四、对所得内生固氮菌株进行总DNA提取，并以总DNA为模板，扩增16S rRNA基因序列，扩增产...
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰，张晓，顾明华，温荣辉，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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