固氮巨大芽孢杆菌株ＤＬ７及其应用制造技术

固氮巨大芽孢杆菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ?ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＬ７及其应用，该菌株于２０１０年６月７日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３９１４。该菌株是对短叶罗汉松根瘤运用常规的微生物分离、纯化方法得到的一株新的固氮菌株，其固氮酶活性１．５６３２ｎｍｏｌ.ｇ－１.ｈ－１，接种桉树苗木后苗高增加４０．７８～５６．２２％，地径增加３９．４１～４６．４３％，单株生物量增加７２．１１～１５８．７６％，叶绿素含量增加１２．９７～２０．９８％，硝酸还原酶活性增加３３．８２～３５．２２％。该菌可以作为制备促进桉树苗木生长的生物菌肥应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是一株固氮巨大芽孢杆菌株 (Baci 1 lusmegaterium) DL7 及胃用。
技术介绍
目前全世界约有5000万hm2的热带人工林，且每年增加300万hm2左右(Binkley et al.，2004)。其中，桉树(Eucalyptus sp.)占热带人工林总面积的40%左右，木材产量 占50 %以上，正发挥着越来越重要的作用。中国的桉树人工林面积已达170万hm2，桉树 已成为我国三大造林树种之一，造林面积仅次于印度和巴西，居世界第三位。桉树速生、高 产、优质，最优杂交家系年平均生长量可达69. 8m3/hm2，最优无性系年平均生长量达64. 8m3/ hm2。桉树产业的发展带动了交通运输业、造纸、人造纤维、人造板工业等的发展，同时为社 会提供了大量的劳动就业机会，为社会稳定起到了重要的作用。桉树人工林也存在很多问题，例如(1)生产力问题。桉树人工林2、3、4代木材蓄 积量分别比第1代下降了 20.9%，38. 7%和50.5% ；生物量分别下降了 19.6%，26. 7%和 44.6%。可见，桉树人工林的地力衰退问题是相当严重的。许多桉树林轮伐期只需4 5 年。这意味着被带走的养分越来越多。除了过度收获外，全垦整地和不合理施肥也会导致桉 树人工林地力衰退。(2)水分问题。20世纪80年代以来，桉树人工林是否较其他树种人工 林消耗更多的土壤水分成为关注的焦点。对比观测地下水位，发现桉树林地下水位深9 11m、裸地为1 4m、混交林为3 4m。桉树是不具有固氮自肥能力的非豆科植物，目前桉树人工林的速生高产完全依赖 施用N、P、K复合肥，导致土壤微量元素缺乏，土壤肥力降低，出现生产力下降；大量施用化 学肥料，导致土壤板结，土壤结构被破坏，林地保水能力差而出现的水分问题。这是实现桉 树可持续发展的最大障碍。然而通过人工接种固氮菌，建立桉树根际联合固氮体系，使原 本不能共生固氮的桉树获得固氮能力，将空气中的分子态氮变为可供桉树吸收利用的氨态 氮，促进桉树生长。这对于日趋贫瘠的桉树林地土壤改良，地力保持具有重要意义和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供经过筛选、具有高效固氮活性、对桉树苗木有明显促进生长 作用的一株固氮巨大芽孢杆菌株(Bacillus megaterium)DL7。本专利技术的另一个目的是提供一株固氮巨大芽孢杆菌株(Bacillus megaterium) DL7的培养方法和在制备促进桉树苗木生长的生物菌肥中的应用。本专利技术人在广泛深入的研究基础上，从非豆科植物罗汉松根瘤分离纯化获得内生 细菌，对其生物学特性、生理生化特性、固氮结瘤能力、接种苗木促进生长等系统试验和检 测。一株固氮巨大芽孢杆菌株(Bacillus megaterium)DL7的培养方法，包括如下步骤从短叶罗汉松侧根上采集有根瘤的细根，用自来水冲洗干净后，用75%乙醇对根 瘤表面进行消毒1分钟，再用0. 1 %的酸性氯化汞消毒5 6分钟。将根瘤置于灭过菌的研 钵中轻轻研磨。取汁液用划线法接种于已加刚果红的YMA培养基上，28°C培养2 3天，挑 选不吸刚果红的菌落，重复划线筛选，然后根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明 程度、边缘形状和菌落颜色的差别，挑选单菌落，经过光学显微镜检查得到所需的纯化完全 的菌株。所述YMA培养基成分及含量为磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0. lg，甘露 醇10. 0g，酵母膏0. 4g，琼脂粉15g，水1000ml,自然ρΗ6· 8，121°C蒸汽灭菌20分钟。固氮巨大芽孢杆菌株DL7的特性1.形态特性在YMA培养基上，菌株的菌落为圆形、乳白色、产粘液、边缘整齐。有鞭毛，可运动。2.培养特性该菌的最适生长条件为pH = 7. 2 7. 4，温度28°C。能利用广泛的碳源和氮源。3.生理特性经革兰氏染色反应镜检为阴性，呈直杆状。4.功能特性对固氮巨大芽孢杆菌株DL716S rDNA PCR序列进行测定，测序结果如序列表所示， 将该菌株的16S rDNA序列在美国国立生物信息中心NCBI网上进行BLAST比较，找到与 Genbank中同源性最高的相关序列，确定该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 用乙炔还原法检测到该菌株有固氮酶活性，其酶活性为1. 5632nmol · g—1 · h—1。接种到桉树 苗木能促进苗木生长，其中苗高增加40. 78 56. 22 %，地径增加39. 41 46. 43 %，单株 生物量增加72. 11 158. 76%，叶绿素含量增力口 12. 97 20. 98 %，硝酸还原酶活性增加 33. 82 35. 22%。本专利技术所述的固氮巨大芽孢杆菌株(Bacillus megaterium)DL7已于2010年6月 7日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 3914。具体实施例方式以下通过具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。实施例1本专利技术所述固氮巨大芽孢杆菌株(Bacillus megaterium)DL7的培养方法，包括如 下步骤1、固氮巨大芽孢杆菌株DL7的分离、纯化从短叶罗汉松侧根上采集有根瘤的细根，用自来水冲洗干净后，用75%乙醇对根 瘤表面进行消毒1分钟，再用0. 的升汞消毒5 6分钟。将根瘤连同细根置于灭过菌 的研钵中研磨，加少量无菌水，研勻后加盖静置，澄清片刻。取上清液用划线法接种于已加 刚果红的YMA培养基上，28°C培养2 3天，挑选不吸刚果红的菌落，重复划线筛选培养，然 后再选择圆形、乳白色、产粘液、边缘整齐的菌落。显微镜检测有鞭毛，可运动，无芽孢。得到纯化完全的菌种。所述YMA培养基成分及含量为磷酸氢二钾0. 5g，硫酸镁0. 5g，氯化钠 0. lg，甘露醇10. 0g，酵母膏0. 4g，琼脂粉15g，水1000ml,自然ρΗ6· 8，121 °C蒸汽灭菌20分钟。2、固氮巨大芽孢杆菌株DL7回接试验试验用Jenson液体培养基的成分及含量为磷酸氢钙1. 0g，磷酸氢二钾0. 2g，硫 酸镁0. 2g，氯化钠0. 2g，三氯化铁0. lg，水1升。每升加Iml微量元素母液，所述微量元素 母液含量如下硼 0. 05 %，锰 0. 05 %，锌 0. 005 %，钼 0. 005 %，铜 0. 002 %。选饱满短叶罗汉松种子，先在75%的酒精中处理1分钟，水洗5 6次，然后用 0. 的升汞表面灭菌6分钟，水洗6 7次，在无菌水中浸种过夜。将吸涨的种子移入无 菌琼脂培养基中，25°C恒温培养催芽。将胚根长至4 5cm的短叶罗汉松幼苗转移到盛有 Jensen培养液的封口三角瓶中，每瓶加2ml菌液，置于光照培养室中培养，以不加菌液作为 空白对照。对照与接种处理各设20个重复。接菌的短叶罗汉松幼苗培养至6个月时，采用日本产GA-9A气相色谱仪，用乙炔还 原法测定幼苗根系的固氮酶活性，测得其酶活性为1. 5632nmol · g—1 · h—1。实施例2用浸根法接种固氮巨大芽孢杆菌株DL7对桉树苗木影响的试验本试验在位于南宁市郊广西国营高峰林场苗圃本文档来自技高网...

【技术保护点】
固氮巨大芽孢杆菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＬ７，其特征在于，该菌株于２０１０年６月７日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３９１４，其具有固氮和促进桉树苗木生长的能力。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕成群，黄宝灵，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]