本发明专利技术涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素Ｃ１９位进行修饰的新衍生物４，５－双氢－７－氧－脱氨甲酰基－７－羟基－１９－氧－甘氨酰格尔德霉素（Ｇｄｍ－ＣＴ－１－１）及其制备方法，通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌１７９９７中的格尔德霉素生物合成基因ｇｄｍＮ，在其变株发酵液中直接获得Ｇｄｍ新衍生物，其水溶性比格尔德霉素高５００倍，为研制临床疗效更好的药物奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及 利用基因工程技术获得格尔德霉素的新衍生物CT-1-1及其制备方法。 技术背景吸水链霉菌17997 (S加; towyc^/^gracopicws 17997)是中国医学科学院医药 生物技术研究所从我国土壤中分离到的，经鉴定其可以产生格尔德霉素 (geldanamycin, Gdm)。 Gdm具有抗原虫、抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种 生物学活性;。根据最近报道，Gdm还具有调节上皮氮氧合酶 活性以及抗炎等作用。经研究证实，格尔德霉素的特异性作用靶点是热休克蛋白卯(heat shock protein 90, Hsp卯)。Hsp卯是许多信号蛋白的伴侣分子，Gdm通过对Hsp90的抑 制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此，有望成为一种颇具潜力的抗肿 瘤和抗病毒药物。但是Gdm还存在毒性大及水溶性差等缺点，水溶性差会影响其 生物利用度，这些缺陷将限制其开发成为有效药物。所以，寻找一种毒性低、水 溶性好的衍生物，已成为其深入研究的主要目标。目前，已有两个在C17位进行 取代的Gdm衍生物17—AAG和17—DMAG,相继在美国进行II期和I期临床试验 ; ;。通过阻断吸水链霉菌17997中的格尔德霉 素生物合成基因一氨甲酰基转移酶基因(gc/mW)的方法，获得一种新的格尔德霉 素衍生物4,5-双氢一7 —氧一脱氨甲酰基一7 —羟基一19一甘氨酰格尔德霉素 (4，5-dihydro-7-0-descarbamoyl-7-hydroxy-19-glycylgeldanamycin )， 命名为 Gdm-CT-l-l。 Gdm-CT-l-l水溶性比Gdm增加了 500多倍。本专利技术所述通过基因 工程技术在C19位进行修饰获得Gdm新衍生物Gdm-CT-l-l及其制备方法，为制 备水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途径。利用生物学方法在GdmC19位进行修饰获得新衍生物的研究，迄今为止，尚 未见有国内外的相关报道。本专利技术提供了格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其结构如式(1)所示:本专利技术还提供了新衍生物Gdm-CT-l-l的制备方法，具体步骤包括 1、 Gdm生物合成阻断变株的构建采用具有氨苄青霉素抗性(AmpR)和硫链丝菌素抗性(TsrR)的大肠杆菌和链 霉菌的穿梭载体pGH112构建基因阻断载体，以吸水链霉菌17997基因组为模板进 行PCR，分别获得与^/miV基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插 入阿普拉霉素(apramydn， Am)抗性基因，并与pGH112载体进行连接，转化大 肠杆菌DH5a ，获得用于目的基因阻断的重组载体；
技术实现思路
:将重组载体转化到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，获得转化子，将其与吸水 链霉菌17997的新鲜孢子共培养，通过接合转移，将重组载体导入吸水链霉菌中。 接合转移子进行传代培养，筛选出An^和Ts一的突变株CT-1。利用PCR方法鉴定 确认，gcfmiV基因阻断变株是通过同源双交换在其中插入Am抗性基因的结果。2、 格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的获得 将CT-1变株进行发酵培养，用等量乙酸已酯萃取发酵液上清，乙酸已酯萃取液经薄膜浓缩获得粗品，在硅胶柱用二氯甲垸洗脱，分部收集，以TLC或HPLC进 行检测，再经制备型HPLC获得格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1纯品。3、 格尔德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的结构鉴定及水溶性测定 经高分辨质谱确定Gdm-CT-l-l的分子量和分子式，经"H和UCNMR分析，并通过化学结构解析，确定Gdm-CT-1-1的结构为4,5-双氢-7-氧-脱氨甲酰基-7-羟 基-19-氧-甘氨酰格尔德霉素。测试结果表明，Gdm-CT-1-1的水溶性比Gdm提高 500倍。 专利技术效果本专利技术通过同源基因双交换阻断技术，破坏吸水链霉菌17997中的格尔德霉 素生物合成基因gafe/^，在其变株发酵液中直接获得Gdm在C19位进行修饰的新 衍生物Gdm-CT-l-l，且其水溶性比格尔德霉素高出500倍，为提供临床疗效更好 的药物奠定了基础。 附图说明-图l: ^加/V基因阻断载体的构建其中All^—阿普拉霉素抗性基因；tsr—硫链丝菌素抗性基因； Amp—氨苄青霉素抗性基因；B—; Bg —彭II; E—fco/ I ; Pi" I ; S—Sac I s X—版I 。图2: PCR产物电泳其中M—入Hind III; 1 —17997原株； 2—CT-1 。 图3: g血;V变株发酵产生的Gdra-CT-1-1HPLC检测图其中A —吸水链霉菌17997;保留时间为24.863分钟， B—Gdm-CT-1-1，保留时间为12. 925分钟。 图4: Gdm-CT-1-1高分辨质谱图谱 图5: Gdm-CT-1-1 1 H氢谱 图6: Gdm-CT-1-1 13C碳i普 实施方案以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本专利技术，但不以任何方 式限制本专利技术。<实施例1> gc/wiV基因阻断重组载体的构建根据gdwiV基因序列(GenbankDQ914285)设计引物(N1-N4)，提取吸水链霉 菌17997 (中国微生物菌种保藏委员会药学微生物菌种保藏中心，保藏号 CPHCC200178)基因组DNA，以此作为模板进行常规PCR。在本实验中采用以 下引物及设计的酶切位点，但不限于所说的引物序列和酶切位点。上游引物(N1): 5，-CCGGAATTCACGGCCTTGGCCAGATCC-3'带有五coRI酶切 位点；下游弓I物(N2): 5，-CGCGGATCCATCCACCCCGCCTCGCAC國3，带有5謡HI酶切位点；扩增949bp片段l。 上游引物(N3): 5，-AAAACTGCAGGCCGTTGAGGCTGGAGTT陽3，带有户M酶切位点；下游引物(N4): 5，-CTAGTCTAGACCGACTGGTTTGGGTGAT-3，带有酶 切位点；扩增963 bp片段2。回收PCR产物片段1和2，在其中间以5amHI-PWl酶切位点插入Am抗性基 因，，并以五coRI-力al酶切位点与携带硫链丝 菌素抗性的pGH112载体(莫宏波等生物工程学报，2004; 20: 662-666)相应酶 切位点进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5ot，提取转化子DNA，经酶切证明，获得基因阻断重组载体pGHEX-gdmN (图1)。 <实施例2> gdmiV变株的基因鉴定gdmiV变株的筛选按照文献进行。将构建的基因阻断重组载体pGHEX-gdmN通过能与吸水链霉菌进 行接合转移的大肠杆菌，如大肠杆菌ET12567/pUZ8002 中传3 4代后，再进行单克隆分离，筛选获得AmK、 Tsrs gdmiV变株。对gc/miV 变株(CT-1)在基因整合水平进行PCR验证。以原株和CT-1变株的基因组为模 板，选取g"mW基因两翼外测序列设计引物Prl和Pr2 (图l)进行PCR。结果表 明，使用引物Prl和Pr2原株基因组PCR产物大小约3.1kb左右，而在CT-1变株 中扩增出将近4.5kb特异性条带(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种格尔德霉素的新衍生物Ｇｄｍ－ＣＴ－１－１，其结构如式（１）所示。 ＊＊＊ （１）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王以光，邵荣光，赫卫清，李永海，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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