一种聚合物微球分离制备格尔德霉素的方法技术

本发明专利技术属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种从发酵培养物中使用聚合物微球分离纯化格尔德霉素的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于エ业微生物
，具体涉及到一种从发酵培养物中分离纯化格尔德霉素的制备方法。
技术介绍
格尔德霉素(geldanamycin，GDM)于1970年被发现于吸水链霉菌(str印tomyces hygroscopicus)的发酵液中，属^·苯酉昆安莎霄素类(benzoquinone ansamycins)。它的结构特征是一个苯醌部分与ー个平面性大环安莎桥相连。具有抗原虫、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、 抗病毒以及免疫调节等多种生物活性。早期被误认为是蛋白酪氨酸激酶抑制剂，然而随着研究的深入，后来才发现GDM特异性作用于热休克蛋白90 (Heat shock protein 90，HSP90) 的ATP结合位点，抑制其ATP酶活性。Geldanamycin近年来热休克蛋白作为药物作用的靶目标正逐渐成为肿瘤治疗中最令人振奋的研究热点之一。格尔德霉素可以通过特异性结合并抑制Hsp90的功能，刺激多种癌基因产物和重要周期调控蛋白的降解，細胞内许多信号传递蛋白的正常功能均依赖于Hsp90，格尔德霉素就是通过干扰肿瘤細胞的Hsp90的正常功能，阻止Hsp90底物蛋白的活化，诱导細胞周期的阻断，同时可以抑制病毒复制，从而起到抑制肿瘤细胞和抗病毒的作用。格尔德霉素特异的作用靶点使其与其它抗肿瘤、抗病毒药物不同，除了自身具有中等的抗肿瘤活性以外，在低浓度条件下，体外可以显著提高顺钼、丝裂霉素C、多柔比星和阿糖胞苷的細胞毒性。GDM可以显著增强顺钼和丝裂霉素C对小鼠肝癌H22的抑制作用， GDM和HSP90C-端抑制剂顺钼联合应用可协同抑制儿童神经母細胞瘤和骨肉瘤，GDM和顺钼联合应用还可协同杀伤卵巣癌A2780cis細胞。自1970年发现格尔德霉素以来，众多化学家合成了大量格尔德霉素的衍生物， 发现了ー些具有较高活性的衍生物。分析发现，格尔德霉素17位是最佳修饰位点，采用小分子烷基胺基取代甲氧基可以得到活性衍生物。目前，对两个新的GDM衍生物17-AAG、 17-DMAG研究最多，正由美国、英国的几家研究机构进行临床II期试验，有望成为新的抗肿瘤药物，格尔德霉素类必将在肿瘤治疗领域展示出良好前景。美国专利US3595955A1公开的格尔德霉素制备エ艺，需要先使用ニ氯甲烷_正丁醇混合溶剂提取，再使用正丁醇进行多次提取，浓缩后再用硅胶色谱柱进行分离，正丁醇沸点高，在浓缩时极易导致格尔德霉素降解，而且步骤繁琐，导致整体收率较低。美国专利 US2003186394A1公开的格尔德霉素制备エ艺，使用ニ氯甲烷提取、浓缩后，直接結晶、过滤， 经异辛烷洗涤，干燥后得到终产品，步骤虽然简便，但产品含量较低，相关物质不能有效得到控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，得到高纯度、高收率的格尔德霉素制备エ 艺。本专利技术首次采用聚合物微球分离纯化发酵液粗提物，通过梯度解析，有效地去除了发酵代谢过程产生的杂质，得到高含量的格尔德霉素精粉，含量大于98.5%，单杂小于1.0%， 总收率大于80%，适于エ业化规模生产高纯度格尔德霉素。下面对本专利技术进行具体描述在本专利技术方法中，通过过滤格尔德霉素发酵液，得到固形发酵培养物，在发酵培养物中加入极性溶剂搅拌浸提，经过滤、浓缩、再过滤，得到格尔德霉素粗提物，粗提物用极性溶剂溶解后上样至聚合物微球层析柱，使用水与极性溶剂的混合液梯度解析，收集格尔德霉素洗脱液，经浓缩、过滤、干燥，得到高含量格尔德霉素精粉。本专利技术所得格尔德霉素可供药品使用，格尔德霉素含量可达98. 5%以上，单杂小于1%，样品回收率大于80%。具体地，本专利技术涉及，包括下述步骤1)在常温条件下对格尔德霉素发酵液进行固液分离，得到固形发酵培养物；2)发酵培养物中加入极性溶剂搅拌浸提，浸提完成后进行固液分离，得到格尔德霉素浸提液；3)减压浓缩浸提液至极性溶剂所占比例小于30% ；4)对浓缩液进行固液分离，得格尔德霉素固形粗提物；5)将格尔德霉素粗提物用极性溶剂溶解，注入聚合物微球层析柱；6)使用极性溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，收集格尔德霉素洗脱液；7)减压浓缩格尔德霉素洗脱液至极性溶剂所占比例小于30%。8)对浓缩后的洗脱液进行固液分离，减压干燥，得格尔德霉素精粉。其中步骤1)、4)、8)中的固液分离可为抽滤、压滤、离心，固形发酵培养物为菌丝体。步骤2)中对固形发酵培养物的单次浸提时间为20-180min，优选60-90min，浸提次数为1-3次，单次浸提溶剂与发酵液的体积比为0. 1-2. 0，优选0. 4-1. 0。步骤2)、5)、6)所述的极性溶剂为甲醇或乙醇、异丙醇、丙酮中的ー种，优选甲醇、 乙醇，各步骤使用的极性溶剂可不相同。步骤幻中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制备的，优选氨基化聚苯乙烯微球、磺酸化聚苯乙烯微球及羧基化聚苯乙烯微球。步骤6)中梯度洗脱的极性溶剂所占比例可为0-100%，优选50-85%。本专利技术有如下优点1.使用聚合物微球层折，大幅度提高了产品纯度，降低了相4关物质含量。2.收率高，全程总收率达到80%以上。3.エ艺简洁，质量可控，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。附图说明附图1 格尔德霉素精粉HPLC检测图谱具体实施例方式下述实施例仅用于阐述实现本专利技术的方法，不应理解为对本专利技术的限制。本专利技术所使用的格尔德霉素发酵液均为华北制药集团新药研发有限责任公司用微生物培养手段得到的。聚合物微球为苏州纳微科技公司生产，乙醇、甲醇等试剂均为市售。本专利技术使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵(Waters公司)。实施例1 取格尔德霉素发酵液10. 0L,发酵单位2. llg/L,真空抽滤，得到2. 03kg菌丝体。在菌丝体中加入6L浓度为95%的乙醇，常温搅拌1小时后真空抽滤，收集滤液。40°C下将滤液减压浓缩至乙醇浓度小于5%，冷却至20°C，真空抽滤，得格尔德霉素粗提物43. 2g，加入无水乙醇64. 8mL溶解，注入长度50cm，直径为5. 5cm,PSA30型聚合物微球装量为IOOOml的层析柱，使用65%浓度乙醇作为流动相洗涤20min，75%浓度乙醇作为流动相洗涤至格尔德霉素洗脱完毕，流速为1500mL/h，根据HPLC检测结果收集洗脱液，40°C减压浓缩洗脱液至乙醇浓度为5%，冷却至20°C，过滤得到格尔德霉素湿粉，将格尔德霉素湿粉在45°C下真空干燥，直至水分小于5%。最后得到17. 6g浅黄色格尔德霉素精粉，收率为82. 43%。精粉HPLC含量为98. 82%，其中最大单杂< 1.0%。其HPLC检测图谱參见附图1。实施例2取格尔德霉素发酵液5. 0L,发酵单位2. 23g/L，真空抽滤，得到1. 13kg菌丝体。在菌丝体中加入2L浓度为99%的甲醇，常温搅拌2小时后真空抽滤，收集滤液，滤饼中加入 IL浓度为99%的甲醇，常温搅拌2小时后真空抽滤，合并过滤液。40°C下将滤液减压浓缩至甲醇浓度小于5%，冷却至20°C，真空抽滤，得格尔德霉素粗提物21. 6g，加入甲醇30mL 溶解，注入长度50cm，直径为5. 5cm, PS30型聚合物微球装量为500ml的层析柱，使用70% 浓度甲醇作为流动相洗涤20min，85%浓度甲醇作为流动相洗涤至格尔德本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，张雪霞，李晓露，王健，王秀捧，王海燕，张金娟，林旸，张丽，林毅，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：