一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的工艺。该方法以镰孢菌属（Fusarium）真菌为出发菌株，主要涉及发酵培养基的新配方、发酵条件控制及分离纯化工艺等步骤。通过本发明专利技术所述的方法，恩镰孢菌素类化合物在前期对数生长期内(10天)能迅速地获得目的产物，最终恩镰孢菌素类化合物的浓度可达2.0g／lkg培养基，具有极高的发酵效价；提取纯化工艺简单，质量可控，样品稳定好，通用性强，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的工艺。
技术介绍
恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)是一类非典型的环肽化合物，结构颇为奇特，分子有3个D-2-羟基异戊酸(HylV)和3个N-甲基氨基酸交替地连接构成十八元环肽骨架，已报道的这类化合物大都是在Fasarium属真菌中找到，迄今为止人们发现了约10个这类化合物(其中EnniatinA，Al，Bl，B比较常见，其它还有Enniatin B2、B3、B4、E、F、G等)。·恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)具有以下通式EnniatinA, Al, BI, B四种化合物中Rl、R2、R3的取代基分别为ElR2RBEnniatinA= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 EnnIatinAi= -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)CH2CH3 -CH(CH3)2 EnniatinBl= -CH(CH3)2-CH(CH3)2-CH(CH3)CH2CH3 EnniatinB = ~CH(CH3)2柳 CH(CH3)2響 CH(CH3)2Enniatins类化合物有很好的抗菌、杀虫、植物毒素活性和胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制作用，近几年这一类化合物的抗HIV和选择性抗肿瘤活性都得到了很多的关注。关于enniatins类抗生素的作用机制，目前认为enniatins是一类离子传导剂,能形成一价离子的“Sandiwich”络合物，穿过细胞膜，尤其是线粒体膜，阻断呼吸链上的氧化磷酸化反应。P. Zavge等认为十八元环状的骨架与一价离子的络合物的亲和カ是其支链骨架的100倍。它们的抗菌活性则是来源于这类物质对ー价钾离子或钠离子的高度选择性络ムロ o1992年Tomoda等发现enniains有抑制脂酰辅酶A :胆固醇脂酰转移酶(Acyl-CoA cho lestero lacy I transferase ACAT)的活性，IC5tl = 22 110 U M。ACAT 在生物体内催化胆固醇3位羟基，由长链脂酰CoA将酰基导入生成胆固醇酷，在胆固醇代谢过程中起着重要作用；因此ACAT被认为是降低胆固醇和防治动脉硬化药物的靶酶。1997年，MaKee等发现enniatins有抗HIV病毒的作用，体外试验显示enniains B,B1和Al混合物的 anti_HIVEC50 = 0. 01 u g -mじ1, IC50 = I. 9 u g -mじ1,其中 enniain B 的 anti-HIV EC50 =·0.16 u M, IC50 = 0. 78 u M0Enniain G是林永成等从海洋真菌Halosarpheia sp.培养液中分离到的ー个新化合物，据初步的药理实验表明，新化合物enniain G具有抗肝癌Heps7402活性，ED5tl = 12 ii g mじ1。Dometshuber R.等报道了 enniains发挥p53依赖性抑制细胞生长，对人体的癌细胞和P53依赖的细胞毒活性。目前国内外极少有关于enniatins生产的报道，仅有少量产品在实验室条件下获得，且主要是通过微生物菌种发酵产生，但是发酵水平普遍不高(0. lg/kg培养基)，而且没有提取纯化工艺方面的报道。因此提供ー种新的制备enniatins的方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术提供了ー种利用铼孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩铼孢菌素类化合物(Enniatins)的生产エ艺。本专利技术共涉及三方面的内容，即固体发酵培养、提取エ艺和纯化工艺。(I)固体发酵培养菌种铼孢菌属产恩铼孢菌素类化合物的任何真菌；培养基组成0 5重量份的氨基酸或蛋白胨、100 2000重量份的水、1000重量份的豆类，PH值为4 8。接种量按质量百分比，将生长好的菌种按1% 20%的比例接种；发酵培养条件于16 32°C,光照培养或暗培养或明暗交替培养,培养周期为4 24天。(2)提取エ艺采用I 30倍体积的有机溶剂提取，收集溶剂部分；回收溶剂后的干膏备用；将上述干膏溶散到体积比为20% 80%醇/水中，以0. 5 20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，干燥备用；(3)纯化工艺以适当的溶剂溶解上述提取物后，采用无机基质为填料的色谱柱，以合适的流动相冲柱，收集高纯度的恩铼孢菌素洗脱部分，干燥后即可得到高纯度的恩铼孢菌素类化合物干粉。本专利技术的优点只需豆类、氨基酸或蛋白胨等简单培养基，繁殖周期4 24天，最終恩铼孢菌素类化合物的浓度可达2. Og/kg培养基，比当前文献报道的产率提高了近20倍，因此，具有成本低，繁埴周期短，提纯エ艺简单等优点。附图说明图I本专利技术所获得的恩铼孢菌素化合物的ESI-MS图谱(示EnniainA，Al，Bl，B)；图2本专利技术所获得Enniain B的1H-NMR谱；图3本专利技术所获得的Enniain B的13C-NMR谱；图4本专利技术所获得的Enniain B的1H-1HCOSY谱；图5本专利技术所获得的Enniain BI的1H-NMR谱；图6本专利技术所获得的Enniain BI的13C-NMR谱；图7本专利技术所获得的Enniain BI的1H-1HCOSY谱；图8本专利技术所获得的Enniatin Al的1H-NMR谱；图9本专利技术所获得的Enniatin Al的13C-NMR谱；图10本专利技术所获得的Enniatin Al的1H-1HC0SY谱；图11本专利技术所获得的Enniatin A的1H-NMR谱；图12本专利技术所获得的Enniatin A的13C-NMR谱；图13本专利技术所获得的Enniatin A的1H-1HC0SY谱。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进ー步的说明，但本专利技术的技术方案并不限于如下实施例。实施例I铼孢菌属真菌三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)的纯化三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号:CCTCC AF 93240菌种的纯化采用划线平板法，将保藏的原始菌种斜面用接种针接种到新鮮PDA平板上，在28°C下培养5-7d，挑出与记载中菌株表观特征描述相符的单菌落，传入两支PDA斜面，一支用于发酵培养和样品初筛，另ー支用于菌种的冷冻保藏。菌株特征在PDA培养基上，菌落乳白色，边缘整齐，两周后直径达到9cm，气生菌丝不发达，短绒状，菌丝浅色，分枝，偶有隔，光滑。分生孢子梗浅色，直立，无隔，偶瓶梗状，顶端鋭，简单，侧生，少有分枝，分生孢子顶生。分生孢子大小两型，大分生孢子浅色，光滑，弯曲，3-4隔有时分隔不清，有足细胞，24-35. 5 X 3. 5-4. 5 u m,小分生孢子浅色，不成链，光滑，0-1隔，梨形或棍棒形，4.5-13.5X1.5-3i!m。厚垣孢子浅色，球形，单生或成串，直径11. 5-13. 5 u nio符合三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)的菌株特征与特性。实施例2 250mL三角瓶的固体发酵三线铼刀菌(Fusarfumtricinctum)接种于斜面培养基上,25°C下培养5天。接着，斜面菌种接种于含IOOg大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用镰孢菌属（Fusarium）真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物（Enniatins）的方法，包括以下步骤：步骤一：固体发酵培养菌种：镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的真菌（可以是从其寄主中分离纯化得到，也可以从菌种保藏中心等机构获得)；培养基组成：0～5重量份的蛋白胨、500～1500重量份的水、1000重量份的大豆，PH值为5～8；接种量：将生长好的菌种按质量百分比1%～20%的比例接种；普通发酵培养条件：于16～32℃，光照培养或暗培养或明暗交替培养，培养周期为4～24天；发酵罐中的条件：罐压0.05MPa，通气量0.6～1.2vvm，发酵时间5？10天；步骤二：目标产物的分离纯化发酵物的预处理：采用1～30倍体积的乙酸乙酯提取，收集溶剂部分；回收溶剂后得干膏；分离工艺：将所得干膏溶散到体积比为20%～80%醇/水中，以0.5～20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，经干燥得灰白色粉末状粗提物；纯化工艺：以适当的溶剂溶解上述粗提物，采用无机基质为填料的色谱柱，以反相流动相冲柱，收集恩镰孢菌素洗脱部分，干燥后即得到恩镰孢菌素类化合物干粉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪建平，张勇慧，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：