参与螺旋霉素生物合成的多肽、编码这些多肽的核苷酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术设计螺旋霉素生物合成途径新基因的分离和鉴定并且涉及参与该生物合成的新多肽。本发明专利技术还涉及产生所述多肽的方法。它还涉及所述基因用于增加所产生的螺旋霉素的产率和纯度的用途。本发明专利技术尤其涉及产生螺旋霉素Ⅰ而不产生螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ的微生物，以及此种微生物的用途。本发明专利技术还涉及螺旋霉素生物合成途径的基因用于构建能够导致新抗生素合成或螺旋霉素衍生形式合成的突变体的用途。本发明专利技术最后涉及过量表达所述基因所产生的分子并涉及过量表达此类基因所产生的分子的药学活性组合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
参与螺旋霉素生物合成的多肽、编码这些多肽的核苷酸序列及其应用本申请是中国专利申请200380102966.6的分案申请，原申请的申请曰 是2003年10月8日，专利技术名称是"参与螺旋霉素生物合成的多肽、编码 这些多肽的核苷酸序列及其应用"。本专利技术涉及螺旋霉素生物合成途径中新基因的分离和鉴定，并涉及参 与该生物合成的新多肽。本专利技术还涉及这些基因用于增加所产生的螺旋霉 素的产量和纯度水平的用途。本专利技术还涉及这些基因用于构建能够导致新抗生素合成或螺旋霉素衍 生形式的突变体的用途。本专利技术还涉及过量表达这些基因所产生的分子， 并且最终涉及过量表达此类基因所产生的分子的药学活性组合物。链霉菌属(Streptomyces)是革兰阳性丝状土壤细菌。由于它们分泌 多种降解酶，所以在有机物质的分解和矿化中具有重要的作用。链霉菌属 表现出形态学上的分化现象，这在原核生物中是唯一的，同时链霉菌属具 有以产生化学结构和生物学活性显著不同的次级代谢物为特征的代谢上的 分化。在这些代谢物中，存在由细菌生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)天然合成的螺旋霉素。螺旋霉素是大环内酯类抗生素，在兽医药和人类医药方面都具有用途。 大环内酯的特征在于存在其上连接有一个或多个糖的内酯环。生二素链霉 菌天然产生螺旋霉素I、 II和III (参照附图说明图1);然而，螺旋霉素I的抗生 素活性明显高于螺旋霉素II和III的抗生素活性(Liu等，1999.)。螺旋霉 素I分子由基于内酯的大环(称为platenolide)和三个糖即forosamine、 碳霉糖和mycarose组成(参照图1)。螺旋霉素的抗生素活性是由于在原 核生物中通过有关将该抗生素结合到细菌核糖体上的机制而抑制蛋白质合 成。属于大环内酯家族成员并也具有内酯环的某些化合物在抗生素领域之外越来越多地^^使用。因此，产物FK506具有免疫抑制剂作用并且在器官 移植领域、类风湿关节炎领域，更加普遍的是对与自身免疫反应相关的病 理疾病具有治疗应用前景。其他大环内酯，例如除虫菌素，具有杀虫和抗 蠕虫活性。到目前为止已对许多生物合成途径在链霉菌属中进行了研究，其中所(综述见K， Chater， 1990 )。然而，到目前为止，螺:旋霉素生物合成途径的 了解还是非常有限的。螺旋霉素生物合成是包括许多步骤并涉及许多酶的复杂过程(Omura 等，1979a， Omura等，1979b )。螺旋霉素属于 一 大类聚酮化合物 (polyketide)，这类聚酮化合物包括在土壤中发现的微生物中特别丰富的复 杂分子。这些分子归为一类不是由于结构类似，而是由于它们的生物合成 途径的步骤中的某点相似性。具体而言，聚酮化合物是通过复杂的一系列 反应产生的，其中共同的方面是，在它们的生物合成途径中，有一系列反 应是由一种或多种称为"聚酮化合物合酶"(PKS)的酶催化的。在生二素链 霉菌中，螺旋霉素基于内酯的大环(platenolide)的生物合成是通过一系列由 五个PKS基因编码的八个组件进4亍的(S. Kuhstoss， 1996，美国专利 5,945,320)。螺旋霉素是从该内酯环得到的。然而，参与糖合成的多个步骤 和酶，以及它们与内酯环连接并对该环进行々务饰以至于获得螺旋霉素目前 仍然是未知的。美国专利5,514,544描述了生二素链霉菌中称为srmR的序列的克隆。 在那个专利中，提出了 srmR基因所编码的蛋白质调控参与大环内酯生物 合成的基因的转录的假说。1987年，Richardson及其同事(Richardson等，1987)研究表明生二素 链霉菌的螺旋霉素抗性是由至少三个基因赋予的；所述基因称为srmA、 srmB和srmC。美国专利4，886，757更加具体地描述了生二素链霉菌含有 srmC基因的DNA片段的特点。然而，该基因的序列未公开。1990年，Richardson及其同事(Richardson等，1990)提出了 srmB附近的三个基因 参与螺旋霉素生物合成的假说。美国专利5，098，837报告了可能参与螺旋霉 素生物合成的五个基因的克隆。这些基因命名为srmD、 srmE、 srmF、 srmG 和srmH。产生诸如螺旋霉素的化合物的主要困难之一在于产生相对少量产物必 需非常大的发酵量这样一个事实。因此期望能够增加此类分子产生的效率 以降低其生产成本。螺旋霉素生物合成途径是复杂的过程并且期望鉴定和去除在该过程中 可能存在的伴生反应。此种操作的目的是获得更纯的抗生素和/或提高产 量。在这方面，生二素链霉菌天然产生螺旋霉素I、 II和III(参照图l); 然而，螺旋霉素I的抗生素活性明显高于螺旋霉素II和III(Liu等，1999)。 因此期望能够有仅产生螺旋霉素I的菌林。由于大环内酯抗生素的商业价值，迫切需要产生新衍生物，特别是具 有有利特性的螺旋霉素类似物。期望能够以足够的量产生螺旋霉素或螺旋 霉素衍生物生物合成途径的生物合成中间体，特别是为了产生螺旋霉素衍 生的杂化抗生素(hybrid antibiotics )。本专利技术涉及对其产物参与螺旋霉素生物合成的基因的克隆。首先，本 专利技术涉及螺旋霉素生物合成途径的新基因和参与该生物合成的新多肽。生物合成途径的基因和相关编码序列已经克隆并且已经确定了每个基 因的DNA序列。下文中将所克隆的编码序列称为orfl*c， orf2*c， orf3*c， orf4六c， orf5、 orf6 orf7六c， or仿 orf9*， orfl0 orfl， orf2， orf3， orf4, orf5, orf6， orf7， orf8， orf9c, orf10， orfllc， orfl2, orfl3c， orfl4， orfl5c, orfl6, orfl7， orfl8， orfl9， orf20， orf21c， orf22c， orf23e, orf24c， orf25c, orf26, orf27， orf28c， orf29， orf30c， orBl， orf32c, orf33和orf34c。由这些序列所 编码的蛋白质在螺旋霉素生物合成途径中的功能在下文中进行讨论，由图 4、 5、 6和8图解i兌明。专利技术概述1) 本专利技术的第 一主题涉及编码参与螺旋霉素生物合成的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列是(a) 序列SEQ ID No. 3， 5， 7， 9， 11， 13， 15， 17， 19， 21， 23， 25， 28， 30， 34， 36， 40， 43， 45， 47， 49， 53， 60， 62， 64， 66， 68， 70， 72， 74， 76， 78， 80， 82， 84， 107， 109， 111， 113， 115， 118， 120， 141， 143， 145， 147和149之一，(b) 由序列(a)的变体组成的序列之一，(c) 由于遗传密码简并性而衍生自序列(a)和(b)的序列之一。2) 本专利技术的主题还涉及在高严格杂交条件下，与至少 一条根据以上段 落l)的多核苷酸杂交的多核苷酸。3) 本专利技术还涉及与包含以上段落l)的多核苷酸中的至少10， 12， 15， 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码参与螺旋霉素生物合成的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列为：　　　　（ａ）选自ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．１１１和１４１的序列之一，　　　　（ｂ）由于遗传密码的简并性而衍生自序列（ａ）的序列之一。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MH布隆德莱鲁奥，H多明格斯，E达尔邦龙热尔，C热尔博，A贡德朗，F卡拉伊，P拉克鲁瓦，N厄斯特赖歇尔梅尔梅布维耶，JL佩尔诺代，K蒂皮海尔，
申请(专利权)人：安万特医药股份有限公司，科学研究国家中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]