本发明专利技术公开了一种生物活性多肽在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-Kv4.2通道抑制剂中的应用方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钾肽-X（SPKP-X），试验验证该活性多肽对电压门控钾通道亚型-Kv4.2通道具有明显的抑制作用。在制备电压门控钾通道亚型工具试剂时，配制细胞外给药的浓度为100 nmol/L或500 nmol/L。SPKP-X的半数有效作用剂量IC50为68 nmol/L。SPKP-X对Kv4.2通道的抑制呈现时间依从性和可逆性，是一种较好的Kv4.2钾通道工具试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-X (简写为SPKP-X)在制备电压门控钾通道亚型工具试剂-Kv4.2通道抑制剂中的用途。
技术介绍
电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程，同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。Kv4.2钾通道属于瞬时外向钾通道，在大脑、心脏、肺和平滑肌中高表达，它是动作电位复极化早期外向电流的主要成分，在调节神经元放电频率和心肌兴奋收缩耦联等方面起重要作用。Kv4.2钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。很显然，借助Kv4.2钾通道的特异性调制剂对这些研究的深入开展是非常必要的。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测Kv4钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料，同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。
技术实现思路
本专利技术旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-X在制备电压门控钾通道亚型工具试剂_Kv4.2通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-X (简写为SPKP-X)，其氨基酸序列为:NH2-Leu Cys Ser Arg Glu Gly Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Arg Lys Cys Cys AlaGly Phe Tyr Cys Lys Ala Phe Val Leu His Cys Tyr Arg Asn-OH，其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-X作为单一有效活性组份用于制备Kv4.2通道抑制剂。所述的蜘蛛抑钾肽-X的N端第I位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成^■硫键。该蜘蛛抑钾肽-X作为单一有效活性组分用于制备Kv4.2通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成Kv4.2通道工具试剂。蜘蛛抑钾肽-X在制备Kv4.2通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为100 nmol/L 或 500 nmol/L。蜘蛛抑钾肽-X抑制Kv4.2通道的半数有效作用剂量1(:5。为68 nmol/L。蜘蛛抑钾肽-X对Kv4.2通道的抑制呈现时间依从性和可逆性，是一种较好的Kv4.2钾通道工具试剂。【附图说明】图1是SPKP-X对大鼠DRG神经元上高电压激活(HVA)钙电流的影响。图2是SPKP-X对瞬时表达于HEK293T细胞的Navl.4钠通道的影响。图3是SPKP-X对表达于爪蟾卵母细胞的Kvl.1钾通道亚型的影响。图4是SPKP-X对表达于爪蟾卵母细胞的Kvl.2钾通道亚型的影响。图5是SPKP-X对表达于爪蟾卵母细胞的Kvl.3钾通道亚型的影响。图6是SPKP-X对表达于爪蟾卵母细胞的Kv4.2钾通道亚型的影响。图7是SPKP-X作用于Kv4.2钾通道亚型的浓度-效应关系曲线。图8是SPKP-X作用于Kv4.2钾通道亚型的时间-效应关系曲线。图9是SPKP-X作用于Kv4.2钾通道亚型的电流-电压关系曲线。【具体实施方式】为了更好的理解和更充分公开本专利技术，下面将通过细胞外给药途径，采用大鼠背根神经节细胞和非洲爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钾肽-X的Kv4.2通道抑制作用。 1、实验材料和方法 1.1大鼠背根神经节细胞(dorsal root ganglia neurons，DRG)的急性分离培养挑选出生4周左右、体重140?200 g的SD大白鼠，断颈处死后，用剪子迅速取出脊椎并剪成2?3段，再沿与肋骨平面垂直的方向将椎管剪开，并浸泡在盛有少量培养液的烧杯中；用镊子撕破附在椎管内壁上的一层黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交汇处的背根神经纤维。在胸腰椎段，可挑选18个左右并置入盛有2 mL培养液的培养皿中；在解剖显微镜下，用尖头镊子和维娜斯剪分离出神经节。剥离包在节外的絮状物和轴索后，放入盛有约0.5mL培养液的培养皿中。用吸管吸去液体，将分离好的所有神经节剪碎，越碎越好。剪碎之后，转入消化液，在34°C、震荡频率110 rpm的环境中进行酶解消化反应20 min。期间每隔10 min取出用移液枪吸打数次；向消化液中加入胰酶抑制剂，终止酶解。无菌操作将消化得到的细胞液转入离心管中进行离心(800 rpm、5 min)，去上清，加入8 mL含10%小牛血清的长期培养液。重悬细胞后分成3?4皿，放入培养箱(5%C02、95%空气)中，37°C培养3?4 h贴壁。1.2通道质粒的扩增和提取 米用promega公司的质粒提取试剂盒(Wizard? Plus SV Minipreps DNAPurificat1n System)。溶液的配方如下: 细胞重悬液细胞裂解液 Tris-HCl (pH 7.5) 50mMNaOH0.2M EDTA1mM1% SDS RNase A100Kg/ml中和液洗脱液盐酸胍4.09M乙酸钾60mM 乙酸钾0.759MTris-HCl (pH 7.5) 8.3mM 冰醋酸2.12ΜEDTA0.04mM pH为4.2加入95%乙醇，终浓度为60%乙醇 操作步骤: 0 收集菌液(4°C，12000r/min，离心 lmin) 0弃上清，用滤纸吸干残留在管壁的溶液，加入250 μ L细胞重悬液，充分混匀 0加入250 μ L细胞裂解液，温和上下颠倒4次混匀，放置5min 0加入350 μ L中和液，温和颠倒4次混匀 0 12000r/min 离心 1min 0吸上清至离心柱中，12000r/min离心lmin，弃下清 0往离心柱中加入750 μ L洗脱液，静置2min，12000r/min离心 lmin，弃下清 0重复第七步，加入250 μ L洗脱液，12000r/min离心Imin弃下 清 0离心柱风干后转移到干净灭菌的1.5mLEP管上，加入50 μ L去核酸酶水 0 10000r/min离心30s，所得的质粒DNA可进行实验或_20°C保存 1.3人胚肾细胞(HEK293T)的培养及转染 HEK293T细胞适应酸性环境，pH值在6.9?7.1时，可顺利贴壁生长，换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。1.3.1细胞的冻存 (I)消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。(2) 100rpm离心10分钟，弃上清液。(3)沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5X106/ml左右。(4)将悬液分至冻存管中，每管I ml。(5)将冻存管口封严。(6)贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。(7)按下列顺序降温:室温一4°C (20分钟)一冰箱冷冻室(一20°C，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钾肽‑X在制备电压门控钾通道亚型工具试剂‑Kv4.2通道抑制剂的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钾肽‑X，其氨基酸序列为：NH2‑Leu Cys Ser Arg Glu Gly Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Arg Lys Cys Cys Ala Gly Phe Tyr Cys Lys Ala Phe Val Leu His Cys Tyr Arg Asn‑OH，其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物‑蜘蛛抑钾肽‑X作为单一有效活性组份用于制备Kv4.2通道抑制剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓梅春，罗旋，
申请(专利权)人：长沙沁才生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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