本发明专利技术提供了新的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。本发明专利技术还提供了包含该多肽的药物组合物，优选是胰菠酶片，用于减轻创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，治疗血栓性静脉炎，治疗泌尿生殖道炎症、治疗关节炎(如，慢性关节炎)或治疗软组织风湿病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质或多肽
，具体而言，本专利技术涉及新的多肽及其药物组 合物，优选还涉及其与其他活性成分组成的胰菠酶片等。另外，本专利技术还涉及上述化学产品 的制备方法和医药应用等。
技术介绍
Phlogenzym片，也称二酶片或胰菠酶片，其活性成分主要由蛋白质组成，用于减轻 创伤后和手术后水肿，缩短血块凝聚时间，减缓肿胀和炎症引起的疼痛，并可用于诸如血栓 性静脉炎、泌尿生殖道炎症、关节炎（如，慢性关节炎）和软组织风湿病等疾病的治疗。然 而，由于在制备片剂时通常需要高温压片，对于含蛋白质的制剂来说，特别容易使得蛋白质 活性降低，因此需要加入更大量的活性蛋白质。而且，高温变性的蛋白质也更容易引起过敏 反应，增加了潜在的安全性隐患。 为此，中国专利申请第200410030650. 7号等现有技术通过直接装入肠溶性胶囊 来避免高温压片，但是这并没有从根本上改变活性蛋白质的性质，尤其是长时间高温储存 的稳定性。 然而，本专利技术人没有受现有技术"走捷径"的方式影响而通过制剂类型和配方等方 式来入手，而是从更为本质的结构改造入手，经过艰苦的研宄和长期的实践，令人意外地研 发出一种新的多肽，其相对于野生型蛋白质（参见GenBank登录号BAA21929. 1)，具有更好 的稳定性，特别适合实际的储运和保存。另外，本专利技术人还研发了一种新的二酶片的生产工 艺，充分利用了其高温储存的稳定性，可以直接采用现有高温喷雾包衣的设备，这与现有的 肠溶胶囊的改进方向正好相反，也不必额外购买制备Ph 1 〇genzym片的低温设备。
技术实现思路
本专利技术的要解决的技术问题在于提供新的多肽及其药物组合物，优选是胰菠酶 片。另外，本专利技术还涉及上述化学产品的制备方法和医药应用等。 具体而言，在第一个方面，本专利技术提供了多肽，其氨基酸序列 (1)如 SEQIDNO :2 所示；或 (2)是在SEQIDNO :2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基 而得的。 本专利技术的第一个方面的多肽的氨基酸序列可以是在SEQIDNO :2所示序列上添 加、缺失和/或取代一个或几个（优选一个至五个，更优选一个至三个）氨基酸残基而得的 氨基酸序列。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载 体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实 验指南》（北京：科学出版社，2002年）等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优 选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧 链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸仏、1、1』4、？、1、￥、￥)、亲水性氨基酸〇?、0、队 C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸（G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸（S、T、 Y)、含硫原子侧链的氨基酸（C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸（D、N、E、Q)、含碱性基团侧 链的氨基酸（R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸（H、F、Y、W)。在本专利技术的【具体实施方式】中，多 肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。 本专利技术的第一个方面的多肽具有GenBank登录号BAA21929. 1所述的野生型蛋白 质的酶活性，例如可以根据Harrach等（J Protein Chem, 14:41-52)所述的蛋白酶活性检 测方法来进行。 优选本专利技术的第一个方面的多肽相对于GenBank登录号BAA21929. 1所述的野生 型蛋白质的稳定性提高，优选是耐高温稳定性和/或长期保存稳定性的提高。在经历高温 和/或一段时间后测定本专利技术的第一个方面的多肽和野生型蛋白质各自的酶活性，可以方 便地显示出本专利技术的第一个方面的多肽的优势。其中，GenBank登录号BAA21929. 1是记录 于公共数据库的现有技术，其描述了提取自植物的野生型蛋白质（酶），目前多直接采用从 植物中提取的方法来获得，几乎没有现有技术对其进行基因工程改造，所以更加无法通过 该野生型蛋白质的氨基酸序列来获得本专利技术的第一个方面的多肽。 在第二个方面，本专利技术提供了多核苷酸，其编码本专利技术的第一个方面的多肽。本发 明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA 和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人 工合成的方法，本领域技术人员可以获得编码本专利技术的第一个方面的多肽的核酸分子或其 片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过 培养宿主细胞进行增殖。优选本专利技术的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。该优 选序列优化了在酵母中的分泌表达。 在第三个方面，本专利技术提供了一种载体，其含有本专利技术第二个方面所述的多核苷 酸。本文中的术语"重组表达载体"、"表达载体"或"载体"，在此可以交互替换使用，是指本 领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒 载体。本专利技术中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体（原核表达载体）、在酵 母中表达用的载体（如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等）、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载 体、在哺乳动物细胞中表达用的载体（痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴 病毒载体等）、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。 总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标 记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性 基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标 志，如His, Leu, Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基 因及荧光蛋白标记基因等。本专利技术的载体优选为真核载体，更优选是酵母表达载体。 在第四个方面，本专利技术提供了细胞，其含有本专利技术第二个方面所述的多核苷酸。该 细胞可以用本专利技术第三个方面所述的载体转化或转染而获得。细胞可以是原核细胞，也可 以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。细胞在转化 或转染含本专利技术所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生 产所需融合蛋白。合适的转化或转染方法包括但不限于：用于细菌细胞，如氯化钙法、电穿 孔法；用于酵母细胞，如电穿孔法和原生质体融合法；用于哺乳动物细胞等，如质体包裹、 磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。优选本专利技术的细胞是酵母细胞。 在第五个方面，本专利技术提供了制备本专利技术的第一个方面的多肽的方法，其包括在 适合蛋白质表达的条件下培养本专利技术第四个方面所述的细胞，然后从培养物中分离出本发 明的第一个方面的多肽。分离的方法包括但不限于：裂菌（超声波裂菌、渗透压裂菌），离 心，盐析，分子筛色谱（又称为分子尺寸排阻色谱），离子交换色谱，吸附色谱（亲和层析、金 属鏊合层析），反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，等电聚焦以及变性/复性处理等。 在第六个方面，本专利技术提供了药物组合物，其包括本专利技术的第一个方面的多肽和 药学上可接受的载体。本文中所用的本文档来自技高网...
【技术保护点】
多肽，其氨基酸序列(1)如SEQ ID NO：2所示；或(2)是在SEQ ID NO：2所示序列上添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴建中，
申请(专利权)人：吴建中，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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