一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法技术

本发明专利技术提供了一种利用普通ＰＣＲ循环仪和植物种内特异单拷贝基因为内标实现转基因植物拷贝数鉴定的简单新方法。其特征在于首先提取待测样品幼嫩叶片的总ＤＮＡ，将所有样品的ＤＮＡ浓度调整一致。设计目标基因和内标基因的特异引物，在ＰＣＲ分子检测的基础上进一步确定最佳ＰＣＲ循环数。然后做目标基因和内标基因在相同循环数下的平行ＰＣＲ及琼脂糖电泳，最后根据二者在电泳图像中的光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。本发明专利技术的积极效果在于：①有益于转基因植物育种中筛选稳定表达的转基因植株；②操作简单、耗时短、费用低廉、安全、准确；③结合了转基因植物的ＰＣＲ分子检测，任何一个做转基因植物ＰＣＲ分子检测的实验室均可实现批量检测而不增加实验设备和难度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法，属转基因植物的分 子检测领域。
技术介绍
随着植物基因工程技术的发展，将外源基因转入植物中以提高植物的产量、 品质、抗逆性或用于某些次生代谢产物的生物反应器等成为可能。转基丙植物 在现代农业技术中扮演越来越重要的角色。转基因的效果有赖于外源基因在转 基因植物中稳定表达。然而，多拷贝重复转基因序列的转基因植物常常使外源 基因不能在转基因植物中稳定表达，甚至完全不表达。这是在转基因植物很容 易发生的现象。特别是花粉管转基因法是外源基因插入有很大的随机性而更易 于产生这种现象。因此，在转基因植物早期筛选中，通过分子检测筛选出已插 入外源基因的转基因植物，同时筛选出单拷贝数转基因植物具有重要的理论价 值和实践意义。 一则可大大减少转基因后期筛选的工作量，二则可提高外源基 因的表达水平和获得稳定表达的转基因植株。检测转基因植物拷贝数最常ffi且准确的方法是Southerii分子杂交法和实时 定量PCR法。Southern分子杂交法需要放射性同位素操作的实验室条件，虽然 也可用非同位素地高辛做标记，但检测的灵敏度降低，也不能改变长而复杂实 验过程。植物种内特异单拷贝数基因常常被用作参照基因来鉴定转基因植物的 拷贝数，如棉花的特异单拷贝数基因SADI(Xu et a1.，2006)，番茄特异单拷贝 数基因液泡转化酶(杜春芳等，2004),水稻单拷贝基因67^适于做为转基因 水稻PCR检测(Ding et a]. ， 2004 )。然而，这种方法是基于实时定量PCR 的方法实现的，其实验设备、试剂、耗材都较昂贵。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种利用普通或梯度PCR循环仪和植物种内特异单拷4贝数基因实现转基因植物拷贝数鉴定的简单新方法。PCR产物的多少在琼脂糖电 泳图像中所形成产物带的光密度的高低不同，并在一定范围内有线性相关关系，PCR的产物多少与样品模板基因的拷贝数和PCR的循环数有直接相关关系。本方 法利用了这一原理，首先将所有待检测样品的DNA浓度调整一致。保证了样品 之间的可比性。然后做目标基因和内标基因在事先确定的相同循环数下的平行 PCR反应及琼脂糖电泳，最后根据目标基因与内标基因PCR产物在电泳图像中的 光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。本方法与转基因植物的检测紧密结合，并利用其结果。在转基因植物PCR检 测的基础上，选取目标基因在电泳图像中最亮带的样品为确定PCR最佳循环数 的样品。 一般说来不同样品同一基因的PCR，在相同的DNA模版浓度和相同的循 环数的条件下，基因的拷贝数多，PCR产物就多。选择目标基因在电泳图像中最 亮带的样品有可能在所检测的样品中选择了基因拷贝数多的样品。用这个样品 做DNA模板，做系列循环数(20， 22， 24，……38)条件下的PCR反应及产物 电泳，在数字化电泳图像中，随着PCR循环数增加，目标带的光密度值增加， 选择目标基因带光密度值出现拐点，内标基因的带也清晰可见的循环数确定为 最佳循环数。在PCR循环数拐点以下，会出现一个PCR产物与光密度值之间相 关的线性区间，为相对定量计算提供了可能。单拷贝基因样品在这个循环条件 下的PCR产物相对较少，其产物在电泳图像中的光密度值会落在这个线性区间 内，有利于鉴别。如果PCR循环数高于拐点，PCR产物与光密度值之间就会失去线性关系，难以分辨差异。当最佳循环数确定之后，做同一样品的目标基因和内标基因在同样循环数 下的平行PCR反应。即做同一样品模板的PCR反应混合液，均分成等份后再加 入不同的引物，在相同循环数下再做相同循环条件的PCR反应及产物电泳，保 证除引物不同之外，PCR反应液、循环数、循环条件(使用梯度PCR循环仪时， 两对引物的退火温度可不同)、产物电泳条件抝相同。使目标基因和内标基因产物间的系统误差减至最小，使单拷贝的内标基因与待测目标基因的拷贝数达到 好的可比性。在电泳图像中，待测目标基因的PCR产物带亮度与内标基因PCR 产物带相似，可S测鉴定为单拷贝外源基因插入样品，亮度显著高于内标基因PCR产物的，为多拷贝外源基因插入样品。然而，目测失之准确，我们引入了 MATLAB软件的自编程序来完成数字化电泳图像中PCR产物带的光密度值计算。 其PCR产物带的光密度值包括了基因扩增带所形成区域的大小和灰度值高低两 个因子。将目标基因带与内标基因带的光密度值进行比较，比值接近l:l的为 单拷贝外源基因插入，大于等于2:1的为多拷贝外源基因插入。这种检测方法具有6个显著的优点(1)操作简单，任何一个做转基因植 物PCR分子检测的实验室均可实现批量检测而不增加试验难度；(2)耗时短， 一批转基因植物样品在几天内即可完成检测；(3)费用低廉，所需仪器、试剂 均为普通PCR实验所需；(4)结合了转基因植物的PCR分子检测，在确定一批 样品的最佳PCR循环数的条件下，在此基础上再做一步PCR反应即可确定待测 样品的拷贝数；(5)安全，不涉及放射性试剂；(6)准确，检测结果与Southern 分子杂交检测相似。具体实施例方式1. 仪器与试剂Bio-Rad梯度PCR仪(美国)，E卯endorf生物分光光度计(德国)，Bio-Rad 凝胶成像仪(美国)，Bio-Rad电泳仪(美国)，水平电泳槽(北京六一厂)， Eppe油rf移液器一套。常规DNA提取试剂；常规PCR试剂(lOXTaq PCR缓冲液，2. 5mM dNTP， Taq酶，超纯水)。目标基因的引物和内标基因特异区引物由华大基因公司(北京)合成。2. 相关软件 Photoshop, MATLAB。3. DNA样品的准备在转基因植物生育期内采集约0. lg幼嫩叶片，用常规提取植物总DNA的方法提取转基因植物的总DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量，用2pl DNA样品稀释在生物分光光度计上检测浓度，使所有待测样品的总DNA的浓度 调整到100ng/|il。4. 引物的设计利用基因引物设计软件(例如Primer5等)，根据转基因植物检测的原则 设计目标基因的引物，根据内标基因的特异区设计内标基因引物。两对引物的 退火温度保持一致较好，也可不同。5. 转基因植物常规PCR分子检测根据待测样品数准备PCR反应混合液，分装在PCR反应管中，在每管中分 别加入等量的待测样品的DNA模板，做30个循环的PCR反应。PCR产物做琼脂 糖凝胶电泳，选择阳性反应中最亮条带的待测样品来确定循环数。6. 最佳循环数的确定为了使凝胶电泳目标基因带的光密度值计算更加客观，需确定PCR最佳循 环次数。在转基因植物PCR分子检测的基础上，选阳性反应中最亮条带的样品 做DNA模板，准备22个PCR反应混合液，分装成2管，l管加目标基因引物，1 管加内标基因引物，分别分装到10个PCR反应管中，在梯度PCR循环仪中进行 扩增。最初在PCR仪中各放入1管PCR反应液，每隔2个循环各放入1管PCR 反应液。PCR反应设定为38个循环，最后72。C延伸10min，形成2组20， 22， 24， 26…，38系列循环数的PCR产物，在琼脂糖凝胶上电泳。在数字化的电泳图 像中，选择目标基因PCR产物带的光密度值出现拐点，并且内标基因的PCR产本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及了一种鉴定转基因植物拷贝数的简单新方法。实验过程首先采集待检测样品的幼嫩叶片，提取总ＤＮＡ。将所有样品的ＤＮＡ浓度调整一致。设计待测目标基因和内标基因的特异引物，在ＰＣＲ分子检测的基础上进一步确定最佳ＰＣＲ循环数。然后做目标基因和内标基因在相同循环数下的平行ＰＣＲ及琼脂糖电泳，最后根据二者在电泳图像中的光密度值的比值来确定目标基因的拷贝数。数字化电泳图像的光密度值计算借助于ＭＡＴＬＡＢ软件完成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王冬梅，范玲，李建平，陈勋基，胡文冉，
申请(专利权)人：新疆农业科学院核技术生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]