本发明专利技术涉及基于荧光通用引物的多重定量ＲＴ－ＰＣＲ基因表达谱分析方法，包括下列步骤：（１）通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计，通用引物的长度为２０ｂｐ，上游通用引物５’端用Ｆａｍ荧光标记，嵌合特异引物长度为３８ｂｐ，３’端为特异引物序列段，５’端为通用引物序列段；（２）多重ＲＴ－ＰＣＲ反应过程；（３）测序仪凝胶电泳予以分析检测。本发明专利技术适用于１０－３０个基因／反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及涉及生物技术基因表达分析领域，具体涉及一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法。
技术介绍
随着现代分子生物学技术和相关检测仪器的发展，基因表达谱分析也迅速发展起来。基因表达谱分析在分析基因功能，确定转录调控途径，阐明信号传导或代谢通路，研究表达水平多态性等方面中都发挥着至关重要的作用，并为分子药物、疾病诊断和治疗领域提供了帮助。人类复杂性状疾病的研究和相关基因的定位是当前的研究热点。糖尿病、癌症、早老性痴呆和精神分裂症等疾病的遗传机理和相关效应基因仍不为人知。通过全基因组转录图谱来查找候选基因(candidate genes)是复杂性疾病研究的第一步，也对进一步理解人类复杂性疾病和分子药物的研发提供了帮助。转录图谱也被用于癌症诊断和疗效比较等临床分析中。基因表达谱可以用于肿瘤分类，进一步研究发现大约30个基因的表达情况可用来预测肿瘤对化学治疗药剂的生物反应状况。全基因组表达芯片(Genome-wide microarrays)能成功的从各种反应条件下筛选出差异表达的基因，这些基因也被作为候选基因进行假设验证和功能分析。芯片技术的优势是通量大， 一次实验所能检测的基因量很大，样本量也较多，但同时也存在着明显的劣势就是芯片的定量准确度较低，并且实验成本很高，只能在经济实力雄厚的实验室推广。基因表达分析中最常用的技术就是实时逆转录定量PCR(real-time qPCR)，它具有Northern blots等技术所不具有的定量分析能力，因此被广泛的用于基因表达定量分析中。Real-time qPCR技术被证明具有稳定性好、灵敏度高和7个数量级的定量线性等优势，但同时它也具有检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。有研究表明人类细胞大约还含有3万个基因，每个细胞平均有大约1万个基因参加表达，而10到50个基因表达和一种特定的疾病相关，10到50个基因和一个特定的通路和药物反应相关。考虑到多基因性状(multigenic traits)受到基因-环境的相互作用影响，发现它们的生物学基础需要在不同的环境条件下处理大量的样本，需要针对对适量的基因在适量的个体或样本中进行分析，因此一种中通量的基因表达分析方法亟待开发。这种基因表达谱检测平台能解决基因表达中高通量与低成本的瓶颈， 一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种定量通量高(10-30个基因/反应)、成本低、样本需要量低、检测灵敏性高的多基因表达分析方法。本专利技术针对11个目的基因和3个看家基因设计了荧光通用引物和嵌合特异引物。通用引物的长度为20bp，上游通用引物5'端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组特异。嵌合特异引物长度为38bp， 3，端为特异引物序列段(18bp) ， 5，端为通用引物序列段(20bp)。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55t:，并且有相似的GC含量。扩增产物的长度在100 400bp间，相邻产物长度差为5 7bp。本专利技术的方法有两种优化方案1.单序列荧光通用引物方案；设计单序列荧光通用引物，使通用引物的上下游序列采用同一序列。这样可以减少通用引物的引物二聚体对扩增反应影响，提高通用引物的扩增效率。2丄游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加方案。在PCR反应过程前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，使各个目的基因的上游嵌合特异引物能最佳退火，同时通用引物的补加也能克服扩增反应初期的通用引物二聚体影响，提高了反应效率。本专利技术提供的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于包括下列步骤(1) 通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计通用引物的长度为20bp，上游通用引物5'端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组无非特异性匹配。针对11个目的基因和3个看家基因设计嵌合特异引物长度为38bp，3'端为特异引物序列段(18bp) ， 5，端为通用引物序列段(20bp)(2) 多重RT-PCR反应过程a逆转录反应阶段，利用下游嵌合特异引物(chimeric reverse primer， 3，端为一段基因特异序列，5'端为一段通用引物序列)逆转录合成目的基因的cDNA第一链；b PCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；c根据荧光标记的PCR产物长度的不同，用ABI377测序仪凝胶电泳予以分析检测。步骤1中所述的通用引物设计上采用上下游同一序列作为通用引物序列。步骤2中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，为11个循环。本专利技术结合了终点PCR法(end-point PCR)和荧光检测法(fluorescent detection),将多对嵌合特异引物的PCR反应转变为一对通用引物的PCR反应大大降低了 PCR反应的复杂性，并且所有待扩目的基因片段也在一对通用引物的作用下被等效率扩增、比例的放大，从而实现多重定量检测。本专利技术适用于10-30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。附图说明图l为本专利技术的原理示意图，图中以一个目的基因模板表示(A) 为利用下游嵌合特异引物的逆转转录反应；(B) 为逆转录反应生成的目的基因cDNA单链；(C) 为PCR反应的前三个循环，由上游嵌合特异引物引导，将通用引物序列加到cDNA模板两端；(D) 为PCR反应余下循环，由通用荧光引物取代嵌合引物完成扩增；(E) 为荧光标记的PCR产物通过ABI Prism 377型核酸分析仪予以分析检测。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计试验步骤(l)通用引物的设计根据GenBank数据库的水稻序列信息，设计了两条20bp长的序列作为通用引物。设计原则是保证该引物在小鼠基因组上进行PCR反应无产物条带，避免通用引物带来非特异产物。通用引物的理论退火温度控制在55°C。上游通用引物5'端用Fam荧光标记。通用引物序列为Fam-cgggctacgctatctacgac (上游)与cgggcagtaagtaccgttgt(下游)。(2)上下游嵌合特异引物的设计根据GenBank数据库的11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息，设计了 14对18bp长的序列作为嵌合特异引物3，端的特异引物序列段。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55。C，并且有相似的GC含量，设计完后在5'端加上通用弓I物序列。扩增产物的长度控制在100 400bp间，相邻产物长度差为5 7bp。目的基因和看家基因的嵌合特异引物的序列为:<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于荧光通用引物的多重定量ＲＴ－ＰＣＲ基因表达谱分析方法，其特征在于：包括下列步骤： （１）通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计 通用引物的长度为２０ｂｐ，上游通用引物５’端用Ｆａｍ荧光标记，嵌合特异引物长度为３８ｂｐ ，３’端为特异引物序列段，５’端为通用引物序列段； （２）多重ＲＴ－ＰＣＲ反应过程： ａ逆转录反应阶段，下游嵌合特异引物逆转录合成目的基因的ｃＤＮＡ第一链； ｂ ＰＣＲ反应过程，前３个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加 到目的基因ＤＮＡ片段的两端；ＰＣＲ反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个ＰＣＲ反应过程； （３）测序仪凝胶电泳予以分析检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李凯，王勤熙，肖君华，赵丽亚，周宇荀，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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