梅、杏及杏梅的PCR快速鉴定区分方法技术

本发明专利技术涉及用一对特异引物快速鉴定区分梅，杏及杏梅的分子水平辅助鉴别方法，属于生物技术领域，用于梅，杏及杏梅的明确分类、苗木早期鉴定及种质资源的遗传评价。用引物２ＭＭＦ／２ＭＭＲ扩增梅、杏及杏梅的基因组ＤＮＡ，通过分析能否扩增出３２１或／与３８７ｂｐ的片段，则能根据梅特异性片段（３２１ｂｐ）和杏特异性片段（３８７ｂｐ）的存在判断出是否为梅或杏以及杏梅。本发明专利技术获得了能够快速鉴定区分梅，杏，杏梅的分子辅助鉴别方法，技术稳定，操作方便，快速准确。利用该特异引物可以实现苗木的早期鉴定，即该方法可以在苗期就能明确区分出三个种，对各树种的生产栽培及种质圃的苗木纯度分析以及遗传资源筛选具有指导作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了梅、杏及杏梅的一次PCR快速鉴定区分方法，属于生物
，利 用特异引物快速鉴定区分梅、杏及杏梅的分子水平辅助鉴别方法，用于梅、杏及杏梅在 分子水平上的明确分类及种质资源的筛选与品种鉴定。二
技术介绍
梅(，"m^附訓e)，原产中国，已有几千年的栽培历史，根据不同的用途可分为花 梅和果梅。其中，果梅则是南方果树的代表树种之一，花梅则是我国重要的花卉植物； 杏(iVi/m^ "rw/w/aca)是中国栽培历史最久的果树之一，在我国北方也有大面积的栽 培。梅、杏都为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(ArmeniacaMill.)植物.由于梅、杏的地理分布、亲缘关系以及某些品种的开花物候期重叠现象的存在等因 素的影响，两者存在着自然杂交的现象，又或者通过人工杂交等辅助手段培育出二者的 杂交种一杏梅。有研究报道梅与杏(iV"mw flnm'w/aca)、紫杏(i^a^c^pa人东北杏 (/^a"tfe^n'cfl)、和山杏(i^6/r/ca)产生能育的F1杂种(BoonprakobU，1990)的报 道。川上繁(1951)，吉田雅夫(1971)调查了日本果梅的所有品种，并以托叶、茸毛、 节部内瘤等实用的形态为基础，判定其杂种程度，分类如下纯梅，杏性梅，中间系， 梅性杏，纯杏(中国果树志*梅巻)。虽然在地理分布以及形态学等生理指标(如开花早 晚等)常常作为区分出梅、杏的标准，但现实中，很多中间类型与梅或者杏、甚至纯梅 与纯杏间往往很难根据植物学性状进行正确的区分。对于杏梅这个杂交种来说，无论是 在形态特征上还是生理生化水平上都介于梅、杏之间，分别具有梅、杏的特征，使梅、 杏的具体分类产生了混淆，目前尚未有一种有效的方法对三个种进行明确的鉴定分类。AFLP (Amplified fragment length polymorphism)是扩增片段长度多态性，是基于 PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，它结合了 RFLP和PCR技术特点，具有 RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。AFLP扩增可在不同品种间形成特定 的DNA谱带指纹。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，根据这些片段 进行多态性或其它分析。本实验通过AFLP对梅与杏不同品种进行多态性分析， 并选择梅与杏不同的特异性公共片段进行回收进一步克隆测序。通过对大量所克隆片段的序列进行分析，发现了大部分序列相同但长度有异的梅与 杏的特异性序列。杏与梅的序列区别在于中间插入了一段68bp的片段。根据所克隆的 序列设计合成特异性引物，对更大量梅、杏、杏梅品种进行PCR扩增，再通过凝胶检 测等一系列技术，发现这一对引物能够有效地在DNA分子水平上鉴定区分梅(pn/m^ wwme)、杏(apricot)及其杂交禾中(hybrid)杏梅(Armeniaca mume Sieb. var. bungo Makino), 为三者的种质资源筛选、品种鉴定提供了可靠的快速鉴定技术。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是根据梅与杏的扩增片段长度多态性(AFLP)的公共 片段开发两种树种的特异的序列，并根据序列设计引物，达到能够在分子水平上快速鉴 定区分梅、杏及两者杂交种杏梅，不仅为三者的明确分类提供了可靠的方法，也为种质资源的搜集与筛选提供了理论依据。本技术的优势是利用一对引物通过一种PCR反应体系即可达到区分杏、梅以及杏梅的目的。技术方案本专利技术的实施方案如下一种用特异性引物区分梅、杏的分子标记辅助鉴别方法，其特征在于用标记引物2MMF/2MMR 左端弓I物序列AGGACTCAAGATCAGAATCATATTATAA 右端引物序列TTTAGTCCTCAACTTTGGAT扩增不同地区的梅(包括果梅和花梅)、杏及杏梅的基因组DNA，如果能够分别扩 增出片段大小321bp的为梅，扩增出片段大小387bp的为杏，同时扩增出片段大小321bp 和387bp的为杂交种杏梅。有益效果本专利技术获得了能够快速鉴定区分梅，杏，杏梅的分子辅助鉴别方法，其优点是(1) 技术稳定。本研究以梅，杏，杏梅的基因组DNA为鉴定材料，DNA遗传稳 定，与普通生理生化指标区分方法不同，不受年份，环境条件的影响。(2) 操作方便，快速准确。利用一对特异性引物， 一次PCR就能够将梅，杏，杏 梅在分子水平上区分开；常规的生理生态指标的区分方法耗时长，对于杏和杏梅来说， 在形态特征和生理指标上具有极大的相似性，很难区分开；通过本专利技术探索出了简单， 快速，准确的区分三个种的方法，筛选出特异引物，建立PCR快速检测技术，减少了 工作量，提高了种质资源搜集的准确度。(3) 利用该特异引物可以实现苗木的早期鉴定，即该方法可以在苗期就能明确区 分出三个种，对各树种的生产栽培及种质圃的苗木移植具有指导作用。也可以用于进行 我国杏、梅及杏梅地理分布的研究。四附图说明图l 2MMF/2MMR在果梅上的扩增结果左右共IO个泳道为果梅代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为莺宿、四川 黄梅、南红、红顶、小欧、七星梅、墨梅、养老3号、福建白粉、细叶青；中间为Marker, 从下至上的四条标记片段大小分别为250bp,500bp,750bp,1000bp;箭头所示为大小321bp 的目的片段。图2 2MMF/2MMR在花梅上的扩增结果左右共20个泳道为花梅代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为南京红顶、 扬州墨梅、南京墨梅、佐乔红、银红朱砂、早朱砂、白牡丹、三轮玉蝶、扣瓣大红、人 面桃花、玉露宫粉、虎丘晚粉、粉皮宫粉、大宫粉、小宫粉、粉玉宫粉、香富宫粉、虎 丘宫粉、粉晕宫粉、乙女宫粉；箭头所示为大小321bp的目的片段。图3 2MMF/2MMR用于杏的扩增结果左右共15个泳道为杏的代表品种的扩增结果，品种从左至右依次为二红杏、白玉扁、鸡蛋杏、大白杏、优l、曹杏、菜籽黄、新疆沙杏、早核甜、柿子杏、巴斗、关爷脸、法l、早香白、绿萼山杏；中间为Marker,从下至上的四条标记片段大小分别为 250bp,500bp，750bp,1000bp;箭头所示为大小387bp的目的片段。 图4 2MMF/2MMR在杏梅上的扩增结果左边的泳道为杏的代表品种扩增结果，品种依次为新泻大实、红荷包、龙井白杏、 东宁2号、蜜陀罗、法2、龙王帽、红金榛、李光、串枝红杏、邢台红接杏、房山红杏； 箭头所示的片段大小为387bp，右边的泳道为2MMF/2MMR在花梅和果梅上的扩增结 果，品种依次为六萼玉蝶、素白台阁、重叶梅、龙泉玉蝶、小绿萼、二绿萼、月世界、 横核、花香实、软条红梅、甲州最小、小梅；箭头所示的目的片段大小为321bp。图5特异引物2MMF/2MMR在杏梅上的扩增结果图为引物在杏梅上的扩增结果，品种从左至右依次为辽梅杏、武藏野、江南无所、 丰后、云南丰后、蝶羽重、送春、杨贵妃、云南杏梅、束花送春、北京丰后、高田丰后、 綦江杏梅；根据Marker的指示标记表明，杏梅扩增出了与梅片段相等和与杏片段相等， 大小各为321bp和387bp的两个目的片段。五具体实施例方式本专利技术的实施程序是(一) 材料与方法本研究所用的梅96个品种、杏梅13个，杏52个品种。品种 名称详见表l (均为公知公用品种)。(二) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
梅、杏及杏梅的ＰＣＲ鉴定区分方法，其特征在于：　用标记引物２ＭＭＦ／２ＭＭＲ，　左端引物序列：ＡＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＡＴＡＡ　右端引物序列：ＴＴＴＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＴ　扩增不同 地区的梅，杏或杏梅杂交种基因组ＤＮＡ，能够扩增出片段大小３２１ｂｐ的为梅，大小３８７ｂｐ的为杏，同时扩增出片段大小３２１ｂｐ和３８７ｂｐ的为杂交种杏梅。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：房经贵，李晓颖，上官凌飞，章镇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]