本发明专利技术公开了植物转基因的可视化跟踪表达系统及其应用。本发明专利技术所提供的可视化跟踪表达系统为含有可视化标记基因表达盒的植物表达载体，所述可视化标记基因表达盒由花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒组成。本发明专利技术将颜色调控基因应用到植物遗传转化操作上，有效减轻了转化后的筛选工作，根据该基因在植株上的表现，可有选择的保留有价值的转化材料，从而大大节省筛选时间和研究经费，且实验结果的准确度和可信度大大提高，这为开展转化后分析工作奠定了很好的基础。另外，本发明专利技术利用颜色基因的瞬时表达，可更为直观地对转化效果进行可视化分析，从而避免各种影响转化因素的发生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物转基因的可视化跟踪表达系统及其应用，特别涉及一种在植物转基因过程中，将花青素合成途径中的两个转录因子bi和Cl基因作为可视化标记基因的植物表达载体。
技术介绍
在众多的植物遗传转化报告基因中，花青素代谢调节基因是最方便的一种。将其导入植物细胞之后，花青素经过表达后会在液泡中积累，使细胞变成红色或紫色，用一般的解剖镜甚至肉眼即可观测，无需对植物的检测部位进行特殊处理或选择特殊仪器进行观察，更不用进行组织化学测试而杀死植物组织。因此，将这类基因应用到植物遗传转化的操作上，可以有效地减轻转化后筛选的复杂工作，目的性强，实验结果的准确度和可信度都可以大为提高，为开展转化后的分析工作奠定了很好的基础。另外在基因功能研究方面，根据该基因在植株上的表现，能够直观地反映出尤其是研究基因共抑制、转基因沉默等转基因植株可能出现的重大问题。已有的研究表明，不同植物中的花青素生物合成受2类基因的共同控制，一类是结构基因，其编码生物合成途径中所需的酶；另一类是调节基因，其编码的转录因子调控结构基因的时空表达(Holton TA,Cornish EC. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. Plant Cell，1995，7 (7) :1071_1083)。早在 1992 年，Gof 等(Goff SA，Cone KC, Chandler VL. Functional analysis of the transcriptional activator encoded by the maize B gene :evidence for a direct functional interaction between two classes of regulatory proteins. Genes Dev. 1992，6 :864-875)证实了玉米中花青素生物合成途径转录因子bHLH蛋白R与MTO蛋白Cl通过N末端相互作用调控植物组织中色素的产生；Cl基因要在b基因的共激活下才能调节色素在糊粉层中的合成，而b位点的基因则很少影响糊粉层和幼苗的颜色，但可调节成熟植物组织特别是叶鞘和苞叶的广谱颜色 (Radicella J P，Turks D，Chandler VL. Cloning and nucle-otide sequence of a cDNA encoding B-Peru, a regulatory protein of the anthocyanin pathway from maize. Plant MolBiol. 1991，17 :127-130)。!fan等(!fan Y JiKim Y MiLee J Y，et al. Production of purple-colored creeping bentgrass using maize transcription factor genes Pl and Lc through Agrobacterium—mediated transformation. Plant Cell Rep. 2009， 28(3) :397-406)在利用玉米的的花青素合成途径的转录因子调控基因Pl和Lc分别或共同转化匍匐剪股颖也得到了类似的结果，这两个基因单独调控时，转基因植株会在不同的部位不同程度显示紫色，Lc基因的调控作用比Pl基因更强一些，但在共同作用的情况下， 会使整个转基因植株呈现紫色。Doshi 等(Doshi K M, Eudes F, Laroche A，et al. Transient embryo-specific expression of anthocyanin in wheat. In Vitro Cell.Dev. Biol. Plant, 2006,42 :432-438)利用来自玉米花青素的转录调节基因Cl和B-peru基因共同在大麦不同的组织特异性启动子驱动下调控花青素的合成，通过颜色直观的反应出这些启动子在小麦幼胚等器官的组织特异性和驱动能力。因此，通过综合考虑并恰当运用结构基因和调节基因，选用具有器官特异性的启动子，为植物转基因研究以及基因功能研究提供了直观的可视化研究证据，另外，还能够为实现植物体彩色化开辟了新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以在植物转基因过程中作为可视化标记的可视化跟踪表达系统，具体为一种植物表达载体。本专利技术所提供的植物表达载体包含可视化标记基因的表达盒。所述可视化标记基因的表达盒可为在植物转基因中任何被用作可视化标记基因的表达盒，在本专利技术的实施例中，所述可视化标记基因的表达盒具体由花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒所组成。其表达产物花青素可作为植物转基因成功与否的可视化参考标记。所述花青素合成途径中的转录因子bi基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途径中的转录因子cl基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述花青素合成途径中的转录因子bi基因的编码序列如序列表中序列4的第 3137位到第4796位所示；所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的编码序列如序列表中序列4的第1013位到第1834位所示。所述花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒是一个含有所述bi基因及bi 基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、被该启动子启动的bi基因和终止子；所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒是一个含有所述 cl基因及cl基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、被该启动子启动的cl基因和终止子。所述花青素合成途径中的转录因子bi基因的表达盒和所述花青素合成途径中的转录因子cl基因的表达盒的启动子均可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的3 启动子。所述植物表达载体还包含筛选转基因植物所需标记基因表达盒。所述筛选转基因植物所需标记基因表达盒为任何在植物转基因中被用作筛选转基因植物所需的标记基因表达盒。在本专利技术的实施例中，所述筛选转基因植物所需标记基因表达盒具体为EPSP基因表达盒。所述EPSP基因表达盒是一个含有EPSP基因及EPSP基因表达所需元件的DNA分子，从上游至下游依次含有如下片段启动子、由该启动子启动转录的所述EPSP基因的编码序列以及终止子(转录终止序列)；所述EPSP基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的编码序列如序列表中序列5的第10 位到第2549位所示。所述筛选转基因植物所需标记基因的表达盒中的启动子可为任何可以启动基因在植物中转录的启动子，如常用的35s启动子。所述的植物表达载体为PBAC9008，pBAC9008按照如下方法构建1)在pGreen载体的第1648位和第沈35位处分别插入如序列表中序列7所示的IoxP位点得到重组载体pBAC814，pBAC814中的两个IoxP位点方向相同；2)在pBAC814 的多克隆位点前的Nde I酶切位点处插入如序列表中序列5所示的所述EPSP基因的表达盒得到重组载体PB本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．植物表达载体，所述植物表达载体包括可视化标记基因表达盒；所述可视化标记基因表达盒由花青素合成途径中的转录因子ｂｉ基因的表达盒和花青素合成途径中的转录因子ｃｌ基因的表达盒组成；所述花青素合成途径中的转录因子ｂｉ基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列１所示；所述花青素合成途径中的转录因子ｃｌ基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨凤萍，张晓东，陈绪清，薛静，张立全，李向龙，宫硖，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11
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