控制植物衰老程序性细胞死亡的方法技术

通过将编码衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶、衰老诱导性elF-5A或二者的基因或基因片段以反义方向整合入植物基因组，可在所述植物中实现调节程序性细胞死亡(包括衰老)表达。鉴定编码衰老诱导性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶和衰老诱导性elF-5A的植物基因，在转基因植物中单独或组合使用每种所述核苷酸序列减缓衰老。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码具衰老诱导性表达的植物多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及含反义方向所述多核苷酸的转基因植物以及控制植物程序性细胞死亡(包括衰老)的方法。更具体地说，本专利技术涉及衰老诱导性植物脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶基因和衰老诱导性elF-5A基因，它们的表达受程序性细胞死亡(包括衰老)发生诱导，植物脱氧8-羟-2， 7，10-三氨基癸酸合酶基因和elF-5A基因单独或组合用于控制植物程序性细胞死亡和衰ο
技术介绍
衰老在植物生命中属于生物发育末期。衰老预示着死亡，并在各个阶段的生物组织中发生，包括全株、器官、花和果实、组织以及个体细胞。衰老的发生可由不同因素引起，既有外部的，也有内部的。衰老在植物或植物组织 (例如果实、花和叶)生命中是一个复杂的高度受控的发育阶段。衰老导致细胞膜和大分子协调裂解，代谢物随后转移至植株的其它部分。除了正常植物发育过程中发生的程序性衰老以外，细胞和组织死亡以及随后的代谢物再转移为对外部环境因素的同步反应。外部因素诱导衰老过早开始，也称作坏死或凋亡，这些因素包括环境压力，例如温度、干旱、日照或营养供应差以及病原体攻击。暴露在环境压力下的植物组织还产生乙烯，通常称为应激乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997， J. Exp. Botany, 48 :181-199 ；Wright,Μ.，1974, Plant, 120 :63-69)。已知乙烯引起某些植物哀老。衰老不是一个被动过程，而是一个涉及特定基因协同表达的主动受控过程。在衰老过程中，总RNA水平降低，许多基因的表达关闭(Bate等，1991，J. Exper. Botany,42, 801-11 ；Hensel等，1993，The PlantCell，5，553-64)。但是，越来越多的证据表明衰老过程取决于核基因从头转录。例如，mRNA和蛋白合成以及去核的抑制剂阻断衰老。体外翻译实验使用衰老叶和绿色叶的mRNA进行分子研究，结果显示衰老阶段的叶蛋白产物图谱改变 (Thomas等，1992，J. Plant Physiol.，139，403-12)。使用差异筛选和扣除杂交技术，已经由一系列不同植物(既包括单子叶植物，也包括双子叶植物，例如拟南芥(Arabidopsis)、 玉米、黄瓜、芦笋、番茄、水稻和马铃薯)中鉴定出许多代表衰老诱导基因的cDNA克隆。衰老过程中特异性表达基因的确定是衰老发生需要从头转录的强有力证据。衰老过程中发生的事件似乎高度协调，以在坏死和死亡发生前最大程度利用细胞组分。为调节该过程，一定在特定信号感知和基因表达级联诱导之间发生了复杂相互作用。 编码衰老相关蛋白的基因表达可能通过普通激活蛋白调节，而这些激活蛋白又由激素信号直接或间接活化。几乎不知道有关该过程初始信号转导或随后协调所涉及的机制。协调基因表达需要涉及转录和翻译的因子，包括起始因子。已经分离并特征鉴定出各种生物(包括植物)的转录起始因子基因。真核生物翻译起始因子5A(elF-5A)是约17KDa大小的必需蛋白因子，它参与真核生物细胞蛋白合成的起始。其特征在于存在 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，它是一个独特的修饰氨基酸，已知仅存在于elF-5A中。通过将多聚胺亚精胺的丁氨基基团转移至elF-5A的特定赖氨酸残基的侧链氨基基团并羟基化，翻译后形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。elF-5A的活化包括将亚精胺的丁氨基残基转移至elF-5A的赖氨酸，形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸并活化elF-5A。在真核生物中，脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)介导elF_5A中 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的翻译后合成。相应的DHS基因还没有在植物中鉴定出来，但已知植物elF-5A含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。已经用甲硫氨酰基嘌呤霉素测定证明， 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰对体外elF-5A活性必须的。8-羟-2，7，10-三氨基癸酸仅存在于elF_5A中，并可见于所有真核生物、某些古生菌(似乎与真核生物相关)中，但真细菌中没有。而且，elF-5A的氨基酸序列高度保守，特别是在8-羟_2，7，10-三氨基癸酸残基周围的区域，提示elF-5A及其活化蛋白脱氧8-羟-2， 7，10-三氨基癸酸合酶在真核生物细胞生理学中基本上执行重要步骤(Joe等，JBC, 270 22386-22392，1995)。已经由人、苜蓿、粘菌、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、烟草和酵母中克隆出elF-5A。原来根据其分离自兔网状细胞裂解物核糖体及其刺激甲硫氨酰基嘌呤霉素合成的体外活性将其鉴定为一般翻译起始因子。但是，更多的近期数据表明，elF-5A不是总体蛋白合成的翻译起始因子，而是用于促进mRNA群特定亚群的翻译。例如，采用动物细胞和酵母的实验强有力地证明，elF-5A的一种或多种同种型在介导参与细胞增殖的mRNA 亚群翻译方面起必不可少的作用。elF-5A在酵母中存在两种同种型，如果两种基因都是沉默的，则细胞不能分裂(Park等，Biol. Signals, 6 :115-123,1997) 0同样，激活elF_5A的酵母脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶表达沉默阻止细胞分裂。实际上，已经开发出脱氧 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶抑制剂，它们可能对治疗高增殖病很重要(Wolff等，JBC, 272 15865-15871，1997)。其它研究表明，elF-5A的另一个同种型对HIV-I复制中的Rev功能或HTLV V复制中的Rex功能是必须的(Park等，Biol. Signals，6 :115_123，1997)。在烟草中还存在至少两种表达的elF-5A基因。基因特异性探针表明，尽管它们在所有检测的组织中都表达，但每种基因都具有不同的表达图谱，推测调节特定转录物的翻译(Chamot等， Nuc. Acids Res.，20 :625-669,1992)。已经由大鼠睾丸、HeLa细胞、粗糙脉孢菌和酵母中纯化出脱氧8_羟_2，7，10_三氨基癸酸合酶。脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶的氨基酸序列高度保守，不同物种的该酶共同拥有相似的物理和催化特性，并表现出与异源elF-5A前体的物种交叉反应性(Park 等，6 Biol. Signals, 6 :115-123,1997)。植物多聚胺涉及各种各样的生理作用，包括成花诱导、胚胎发生、病原体抗性、 细胞生长、分化和分裂(Evans 等，1989，Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol.，40， 235-269 ；和 Galston 等，1990，Plant Physiol.，94，406-10)。已经表明，elF_5A 是中间体，多聚胺通过 elF-5A 发挥其作用(Chamot 等，1992，Nuc. Acids Res.，20 (4)，665-69)。已经鉴定出两种编码烟草elF_5A同种型的基因(NelF_5Al和NelF_5A2) (Chamot 等，1992，Nuc. Acids Res.，20 (4)，665-69)。研究显示两种基因非常相似。但是，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种控制植物中程序性细胞死亡的方法，所述方法包括：（１）使一种载体整合入所述植物基因组，所述载体包含：（Ａ）反义核苷酸序列，其：（ｉ）与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１表示的内源衰老诱导性脱氧８－羟－２，７，１０－三氨基癸酸合酶基因的３′末端核苷酸序列互补；或（ｉｉ）与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１表示的内源衰老诱导性脱氧８－羟－２，７，１０－三氨基癸酸合酶基因３′末端核苷酸序列编码的ＲＮＡ序列互补；（Ｂ）调节序列，该调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接使得表达所述反义寡核苷酸序列；和（２）培育所述植株，由此转录所述反义核苷酸序列并结合所述ＲＮＡ序列，因而抑制所述衰老诱导性脱氧８－羟－２，７，１０－三氨基癸酸合酶基因表达。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·E·汤普森，T·W·王，D·L·卢，
申请(专利权)人：森尼斯科技术公司，
类型：发明
国别省市：US