标记核糖核酸的方法和由此获得的标记RNA片段技术

本发明专利技术涉及标记合成或天然的核糖核酸（ＲＮＡ）的方法。本发明专利技术还涉及根据该方法标记的ＲＮＡ片段及其应用。所述方法包括：将ＲＮＡ片段化；在位于所述ＲＮＡ每个片段的３’端和／或５’端的末端磷酸上标记，所述磷酸末端是在片段化过程中释放的。本发明专利技术优选应用于医学诊断领域。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及标记合成或天然核糖核酸(RNA)的新方法。合成RNA是指通过人们开发的技术例如扩增技术(PCR后转录)或转录扩增技术(TMA)获得的RNA。天然RNA是指通过从细胞提取获得的RNA，例如信使RNA、核糖体RNA或转运RNA。现有技术显示，标记核苷酸、寡核苷酸或核酸有许多方法；寡核苷酸和核酸将用术语多核苷酸表示。寡核苷酸可在合成中标记或通过掺入至少一个标记的核苷酸来标记。第一种方法包括将标记附加在碱基上，后者可以是天然碱基也可是修饰碱基。第二种方法是将标记附加在糖上，同样后者可以是天然糖也可是修饰糖。第三种方法涉及将标记附加在磷酸上。标记碱基特别用于通过直接掺入标记的核苷酸来标记核酸的方法。标记糖常常用于通过化学合成制备核酸探针的情况。标记磷酸则用于在化学合成多核苷酸时导入功能化的臂或标记。实际上，标记核苷酸或核苷酸类似物或核酸的技术人员倾向于将标记附加在碱基或糖上，这给他提供更多的方便和更大的选择。而且，大量文献研究也显示这种情况，例如标记碱基的文献EP-A-0,329,198、EP-A-0,302,175、EP-A-0,097,373、EP-A-0,063,879、US-A-5,449,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3,910,151和EP-A-0,567,841，或标记糖的文献EP-A-0,286,898。然而，这些技术有许多缺点，两个主要缺点是标记的存在造成的空间障碍和影响。当标记碱基时，空间障碍是由于标记侵占了相邻碱基的空间，不管该相邻碱基是由相同链还是互补链的临近核苷酸所携带。同样非常明显，碱基上标记的存在可削弱酶促掺入过程中的效率和特异性，并可影响两条互补链间氢键的质量，从而对杂交不利。当标记糖时，空间障碍是由于标记侵占了相同链携带的相邻糖基的空间。该标记的存在可疏远相同链携带的两个相邻碱基，从而妨碍了与互补链的有效杂交，因为链间氢键不是最佳的。将标记附加在磷酸上的技术比功能化碱基和糖所涉及的技术更为复杂。即使如此，仍有一些文献提出了标记磷酸的技术。例如文献EP-A-0,280,058，其描述了通过将标记附加在磷酸上来标记核苷酸的方法，其中当核苷酸是脱氧核糖核苷酸时，磷酸在2’和/或5’位与糖相连，当核苷酸是核糖核苷酸时，磷酸在2’、3’和/或5’位与糖相连。该文献还描述了包含至少一个上述标记核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸；该核苷酸在合成过程中掺入多核苷酸或寡核苷酸中。然而，文献EP-A-0,280,058提出的标记方法不能使核酸均匀标记。这是因为不能控制标记核苷酸在多核苷酸中的掺入；这完全取决于待合成多核苷酸的组成。因此，一些多核苷酸可能包含大量标记核苷酸，而其它多核苷酸可能根本不含任何标记核苷酸。结果，这些核酸发出信号的强度将不均一，这样在检测这些核酸时很容易引起结果难以解释。在该情况下，标记是一种生物标记，人们不能控制标记核苷酸的位置。文献US-A-5,317,098涉及5’末端标记的核酸。该标记采用咪唑和接头臂。没有相关的片段化。而且，添加了磷酸，因此使用激酶。然而，理论上核酸的每个游离末端均存在磷酸，导致至少增加一个步骤。该标记不涉及任何片段化。此外，上两篇文献所述标记是在大的核酸上进行的。实际上，在标记步骤之前没有描述片段化阶段，也称作切割阶段。结果，当对这些靶核苷酸与捕获探针杂交时，杂交后形成的双链不稳定。当使用多核苷酸作为检测探针时，也会出现该情况。原因可能是空间障碍，或者合成的多核苷酸及其大小不一定相同的靶标之间缺乏特异性。因此，这将导致数量和质量上的信号损失。空间障碍可能不仅是核酸长度的结果，而且也是二级结构存在或维持的结果。片段化可破坏这些结构，这样就可优化杂交。在与含有高密度捕获探针的表面如Affymetrix公司开发的DNA芯片杂交时该空间障碍起着特别重要的作用(“用高密度DNA阵列获取遗传信息(Accessing Genetic Information with High-Density DNAarrays)”,M.Shee等，科学(Science),274,610-614。“光产生的用于快速DNA序列分析的寡核苷酸阵列(Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis)”,A.Cayiani Pease等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1994,91,5022-5026)。在该技术中，捕获探针大小通常减少，为约20个核苷酸。本领域现有技术描述了大量核酸片段化的方法。首先，片段化可以是酶反应的，即核酸可通过核酸酶(DNA酶或RNA酶)片段化。这将产生具有3’-OH、5’-OH、3’-磷酸和5’-磷酸末端的小片段。其次，片段化可是化学反应的。例如对于DNA，可将DNA脱嘌呤或脱嘧啶，然后该DNA通过所谓的“β-消除”机制在碱存在下片段化。特别地，DNA可通过氧化、烷基化或加入自由基的机制片段化。经常与用作化学催化剂的有机分子如咪唑结合的金属阳离子可用于RNA的片段化。优选地，该片段化在碱性介质中进行，并产生具有3’磷酸末端的片段。然而，这些片段化的目的不是为了便于或允许标记。文献WO-A-88/04300提出了一种片段化并标记RNA的方法，该片段化是采用具有酶特性的RNA即核酶来进行的。通过每次切割，这种使用核酶的片段化释放一个核酸(5’)HO末端和一个核酸(3’)HO-PO2末端。然后，通过掺入酶(激酶)实现这种只是放射性的标记，其中加入酶可掺入一个来自γ-GTP分子的增加的放射性磷酸。这种掺入只在5’端进行。而且，片段化仅由核酶来实施，这暗示在核酶和待切割的靶核酸之间存在特异性。然后，磷酸充当标记。本专利技术将标记接合在切割过程中释放的核酸片段的单一磷酸上。由于没有特异性，所以任何类型的核酸均可以随机的方式片段化。这样，我们的方法可制备例如检测探针。最后，磷酸只是核酸和标记之间的接头臂。现有技术没有描述在一或两步的标记之前片段化的方法。因此，本专利技术提出了克服前面提到的缺点的方法。这样，该方法可在片段化完成之后即获得均一标记的RNA片段。此外，该片段化可获得对于可能的杂交具有最佳大小的片段。随着杂交质量的改善，该杂交的检测将更为快速和有效。标记是指附加能产生可被直接或间接检测的信号的标记。下面是这些标记的非限制性列表●产生可通过例如比色、荧光、发光检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，●发色团，例如荧光和发光化合物和染料，●具有可通过电子显微镜或通过其电学性质如导电率、电流测定法、伏安测量法和阻抗进行检测的电子密度的基团，●可检测的基团，例如大小足以诱导其物理和/或化学性质可检测的改变的分子；该检测可通过光学方法例如衍射、表面等离子体振子共振、表面变化和接触变化角，或物理方法如原子力光谱和隧道效应来进行，●放射性分子，例如32P、35S或125I。也可使用间接系统，例如能与抗配体反应的配体。配体/抗配体对是本领域技术人员所熟知的，例如下列配体/抗配体对的情况生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
标记合成或天然核糖核酸（ＲＮＡ）的方法，其特征在于它包括：－将ＲＮＡ片段化，和－在位于所述ＲＮＡ每个片段的３’端和／或５’端的末端磷酸水平上进行标记，所述末端磷酸是在片段化过程中释放的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A勒扬，
申请(专利权)人：比奥美希奥公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]