新型表达调节性RNA分子及其用途制造技术

本申请涉及包含RNA‑聚合酶结合适配子的RNA分子，其中所述RNA‑聚合酶结合适配子的长度为15至60nt，其中所述RNA‑聚合酶结合适配子以50nM或更低的KD结合RNA‑聚合酶。此外，本申请公开了包含编码本发明专利技术的RNA‑聚合酶结合适配子的序列的DNA分子，以及产生目标蛋白或RNA的方法，所述方法包括提供根据本发明专利技术的载体(所述载体包括表达载体)，将所述载体引入宿主细胞，和在诱导来自表达载体的启动子的转录的条件下于培养基中培养所述宿主细胞，以及任选地从宿主细胞或培养基中回收目标蛋白。此外，本申请涉及利用RNA‑聚合酶结合适配子体外转录和表达的方法。

New expression of regulatory RNA molecules and their uses

The invention relates to containing RNA polymerase binding aptamer RNA molecule, wherein the RNA polymerase binding aptamer for the length of 15 to 60nt, wherein the RNA polymerase binding aptamers to 50nM or lower KD combined with RNA polymerase. In addition, DNA molecules are disclosed comprising encoding the RNA polymerase binding aptamer sequence, and the target protein or RNA, the method includes providing according to the vector of the present invention (including the carrier, the expression vector) vector into the host cell, and the transcription induced from the expression vector promoter under the condition of the cultured in the host cell, and optionally from host cells or culture medium protein recycling targets. In addition, the invention relates to a method of binding aptamers in vitro transcription and expression of RNA by polymerase.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型表达调节性RNA分子及其用途专利技术的
本专利技术涉及生物学领域，特别是生物
更具体地，本专利技术涉及RNA-生物学领域及其在调节基因表达中的意义，例如用于在宿主细胞中表达目标基因。专利技术背景在细菌中，从起始至延伸和终止的所有转录步骤均倾向于受反式作用蛋白和小RNA的调节。此外，新生RNA自身含有许多顺式作用调节信号。核糖开关是主要编码于新生RNA的5’UTR中的顺式作用RNA元件，其直接感知小的代谢物、离子、温度或pH，导致转录、翻译或RNA加工的调节(A.Serganov，E.Nudler，Cell.152，17-24(2013)；和S.Proshkin，A.Mironov，E.Nudler，Biochim.Biophys.Acta(2014)，doi：10.1016/j.bbagrm.2014.04.002)。终止信号是调节性RNA信号的另一实例，其可以分为两个大组：内在终止子和依赖因子的终止子(E.Nudler，M.E.Gottesman，GenestoCells.7，755-768(2002)；和J.M.Peters，A.D.Vangeloff，R.Landick，J.Mol.Biol.412，793-813(2011))。富含GC的RNA发卡，之后是一段尿苷，这是独立于辅因子而引起终止的内在信号。依赖因子的信号处的终止需要存在识别特定RNA区域的蛋白因子，如Rho。新生RNA还可以增加RNAP的持续合成能力，提供依赖因子的或不依赖因子的抗终止信号。例如，噬菌体HK022putRNA在整个延伸过程中直接结合RNAP，使其抵抗终止(R.Sen，R.A.King，R.A.Weisberg，Mol.Cell.7，993-1001(2001)；和N.Komissarova等人，Mol.Cell.31，683-94(2008))。在进行性抗终止期间，依赖因子的顺式作用nutRNA(boxA+boxB)协助噬菌体λN蛋白以及细菌NusA、NusB、S10。迄今为止未能发现共同属性。但是，所有已知的调节元件要求独特的二级结构，这使得它们难以设计。因此，对不需要独特的二级结构的调节性RNA序列存在需求。当引入宿主细胞中用于表达时，在宿主细胞中异源表达的序列通常倾向于具有调节作用的序列。它们可以抑制表达，例如在转录或翻译的终止方面。例如，异源序列可以含有对在宿主细胞中的表达具有抑制作用的序列。这将导致对表达的非需要的限制。此外，宿主细胞中靶序列表达的输出可受在宿主细胞中具有调节作用的周围序列的影响。此外，由于转录相对链的聚合酶的互相妨碍，反向互补链的非需要的转录(例如，通过未鉴定的启动子序列进行的)可能引起转录效率的损失。因此，需要与待表达的序列内可能存在的抑制性元件无关的、允许目标序列在宿主细胞中适当表达的工具。具体地，允许重组蛋白在宿主细胞中高效产生的工具缺失或者被需要。尽管利用启动子(如诱导型启动子)通常可以调节或增强转录的起始和量，翻译效率的调节仍未充分解决。此外，当产生的蛋白对于宿主细胞具有有害作用时，异源宿主细胞中例如产生蛋白的某些序列的表达可能造成困难。现今，采用利用诱导型启动子的表达系统。此类启动子仅在存在某些刺激的情况下有效起始转录，例如向培养基中添加某种化合物。但是，此类启动子通常在未刺激的环境中促进基础表达，导致启动子的一定的泄露。如果蛋白具有有害作用，一旦诱导表达，这可能具有不利影响，并且可能导致无效表达。本专利技术的专利技术人现在提供一类新型调节性RNA适配子，其在克服以上概述的缺陷中提供强大的作用。专利技术描述本专利技术的专利技术人有趣地发现了以高亲和力与RNA-聚合酶相互作用的短的RNA-聚合酶结合适配子(称为RAP)。本专利技术的专利技术人确实鉴定了一些天然存在的RAP。此外，他们发现这些适配子能够调节编码它们的DNA-序列的表达。因此，提供了调节RNA-聚合酶的全新工具，并因此提供了用于调节宿主细胞中DNA编码的分子，如RNA和/或蛋白的表达的工具。因此，本专利技术一方面涉及包含RNA-聚合酶结合适配子的RNA分子，其中所述RNA-聚合酶结合适配子的长度为15至60nt，并且其中所述RNA-聚合酶结合适配子以高亲和力结合RNA-聚合酶，优选以50nM或更低的KD，优选以10nM或更低的KD结合RNA-聚合酶。本专利技术还涉及编码本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子的DNA-分子。本专利技术还涉及表达盒，其包含编码本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子的序列和启动子，其中编码所述适配子的序列可操作地连接至所述启动子。此外，本专利技术涉及载体，优选用于表达目标序列的载体，所述载体包含编码本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子的序列。在优选实施方案中，载体还包含启动子、用于整合目标序列的多克隆位点。载体可以包含本专利技术所述的DNA-分子，优选本专利技术所述的表达盒。此外，在本专利技术的一个方面，表达盒包含编码启动子下游的抑制型RNA-聚合酶结合适配子的序列的反向互补序列。在本专利技术的一个方面，表达盒包含启动子、待表达的DNA序列或用于插入待表达的DNA序列的多克隆位点以及编码所述待表达的DNA序列或所述多克隆位点下游的3’UTR的DNA序列，其中编码3’UTR的DNA序列包含编码本专利技术所述的抑制型RNA-聚合酶结合适配子的DNA序列的反向互补序列。本专利技术还涵盖包含本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子的宿主细胞。此外，本专利技术涉及包含DNA分子的宿主细胞，所述DNA-分子包含编码本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子的序列。此外，本专利技术涉及表达目标序列，优选DNA序列的方法，其包括下述步骤：提供本专利技术所述的载体，所述载体包含本专利技术所述的表达盒，将所述载体引入宿主细胞，以及在诱导或允许来自表达载体的启动子转录的条件下于培养基中培养所述宿主细胞。此外，本专利技术涉及本专利技术的RNA-分子或DNA-分子或表达盒或载体用于调节待表达的序列的表达的用途。换言之，在表达待表达的序列的方法中使用本专利技术所述的RNA-聚合酶结合适配子，例如通过在编码待表达的序列的同一DNA分子上编码所述适配子而顺式使用。附图说明图1.大肠杆菌基因组中RNA-聚合酶结合适配子(RAP)的分布。(A)根据RAP在大肠杆菌基因组上的位置对RAP进行的分类。灰色箭头显示带注释的基因。将RAP的位置描绘为三角形。(B)来自大肠杆菌基因组内不同分类的RAP的分布。(C)-(D)带注释的基因内正义(C)和反义(D)RAP位置的分析。亮线显示所有注释的ORF的各区域(+10％上游/下游)中存在的RAP的计数。背景(黑色)显示来自1000次随机运行的各信号。图2.GFP报告系统(由细菌RNA-聚合酶(RNAP)驱动)中的激活型RAP的作用。(A)用于检测位于GFP报告基因(GFP)上游的激活型RNA-聚合酶结合适配子(RAP；长方形)的作用的报告构建体的示意图。“P”(灰色三角形)指示组成型细菌RNAP启动子的位置。TSS：转录起始位点；RBS：核糖体结合位点。下方描绘了qRT-PCR扩增子的位置(透镜状的条)。(B)使转化有含有不同RAP的GFP报告质粒的大肠杆菌细胞在LB琼脂平板上生长，随后进行荧光强度测量(左图-GFP模式)。也在可见光下对同一平板进行捕获，其显示含有RAP-G本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含RNA‑聚合酶结合适配子的RNA分子用于调节待表达的序列的表达的用途，其中所述RNA‑聚合酶结合适配子的长度为15至60nt，优选20至50nt，并且其中所述RNA‑聚合酶结合适配子以50nM或更低的KD结合RNA‑聚合酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.01 EP 15162198.41.包含RNA-聚合酶结合适配子的RNA分子用于调节待表达的序列的表达的用途，其中所述RNA-聚合酶结合适配子的长度为15至60nt，优选20至50nt，并且其中所述RNA-聚合酶结合适配子以50nM或更低的KD结合RNA-聚合酶。2.如权利要求1所述的用途，其中所述RNA-聚合酶结合适配子用于顺式调节待表达的序列的表达。3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述RNA-聚合酶是原核RNA-聚合酶或真核RNA-聚合酶。4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述RNA-聚合酶结合适配子与大肠杆菌(Escherichiacoli)RNA-聚合酶的全酶或者与酵母或智人(Homosapiens)RNA-聚合酶II相互作用。5.如权利要求4所述的用途，其中所述RNA-聚合酶结合适配子是转录增强型RNA-聚合酶结合适配子。6.如权利要求5所述的用途，其中所述转录增强型RNA-聚合酶结合适配子增加待表达的序列的表达，其中所述表达与未包含所述RNA-聚合酶结合适配子时所述待表达的序列的表达相比增加至少10％。7.如权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述转录增强型RNA-聚合酶结合适配子由SEQIDNO：139的序列编码，优选由SEQIDNO：1或SEQIDNO：138的序列编码；优选由与选自下述的序列具有至少80％的同一性的序列编码：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22、SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、SEQIDNO：72、SEQIDNO：73、SEQIDNO：74、SEQIDNO：75、SEQIDNO：93、SEQIDNO：94、SEQIDNO：95、SEQIDNO：96、SEQIDNO：97、SEQIDNO：98、SEQIDNO：99、SEQIDNO：100、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：105、SEQIDNO：106、SEQIDNO：107、SEQIDNO：108、SEQIDNO：109、SEQIDNO：110、SEQIDNO：111、SEQIDNO：112、SEQIDNO：113、SEQIDNO：114、SEQIDNO：115、SEQIDNO：116、SEQIDNO：117、SEQIDNO：118、SEQIDNO：119、SEQIDNO：120、SEQIDNO：121、SEQIDNO：122、SEQIDNO：123、SEQIDNO：124、SEQIDNO：125、SEQIDNO：126、SEQIDNO：127、SEQIDNO：128、SEQIDNO：129、SEQIDNO：130、SEQIDNO：131、SEQIDNO：132、SEQIDNO：133、SEQIDNO：134、SEQIDNO：135、SEQIDNO：136以及SEQIDNO：137。8.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述RNA-聚合酶结合适配子是抑制型RNA-聚合酶结合适配子。9.如权利要求8所述的用途，其中所述抑制型RNA-聚合酶结合适配子降低待表达的序列的表达，其中所述表达与未包含所述RNA-聚合酶结合适配子时所述待表达的序列的表达相比降低至少30％，优选至少20％，甚至更优选至少50％。10.如权利要求8或9所述的用途，其中所述抑制型RNA-聚合酶结合适配子具有大于27％的C-含量和少于23％的G-含量。11.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述抑制型RNA-聚合酶结合适配子由选自SEQIDNO：84、SEQIDNO：85、SEQIDNO：86和SEQIDNO：87的序列编码；优选地，所述抑制型RNA-聚合酶结合适配子由与选自下述的序列具有至少80％的同一性的序列编码：SEQIDNO：25、SEQIDNO：26、SEQIDNO：27...

【专利技术属性】
技术研发人员：蕾妮·施罗德，娜杰日达·西门亚诺娃，
申请(专利权)人：维也纳大学，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT