一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用制造技术

本发明专利技术属于细胞生物技术领域，具体涉及一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用，能够特异性结合143B的核酸适配体序列LP4：5’‑ ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT‑3’。本发明专利技术所述核酸适配体具有高特异性、高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点，在研究骨肉瘤转移的转移性肿瘤标志物、转移性骨肉瘤的靶向诊断和治疗方面，以及在制备骨肉瘤转移的诊断试剂、治疗骨肉瘤转移的药物等方面具有广阔的应用前景。

A nucleic acid aptamer for targeting highly metastatic human osteosarcoma cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体及应用
本专利技术属细胞生物
，具体涉及一种人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。
技术介绍
肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一,也是肿瘤治疗失败的最根本原因。大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。骨肉瘤（Osteosarcoma）是青少年中最常见的原发于骨的恶性肿瘤，具有很高的全身转移倾向，大约20%的患者在初次诊断时已经发生肺转移，另外还有40%的患者晚期发生远处器官转移。目前，针对骨肉瘤的主要治疗措施是截肢以及手术前后的化疗、关键部位的放疗等，但无论是原发性骨肉瘤还是转移性骨肉瘤，对常规的化疗药物都具有耐药性，肿瘤耐药是骨肉瘤患者保肢手术治疗失败及发生转移的主要原因，而肿瘤发生转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。因此，准确地对骨肉瘤及其转移做出早期诊断和有效的抑制，并探求骨肉瘤特异性肿瘤标志物和特异性治疗靶点已经成为骨肉瘤治疗的关键。核酸适配体是一类有20～100个碱基的单链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以其适宜的空间三维结构特异性识别靶标分子，并与之结合。近年来，核酸适配体以其尺寸小、稳定性高、成本低、易修饰、与靶标亲和力高，特异性好，以及其成产简单，不需要活体或者细胞，可以体外人工合成等优势，在生物医学、生物化学等领域取得了突飞猛进的进展，成为肿瘤研究的一个有效的手段，在未来生物研究领域将有不可估量的发展空间。因此，找到特异性识别人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的人高转移性骨肉瘤细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：利用Cell-SELEX技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U-2OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，从体外合成的随机寡聚DNA文库（5’-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’）中，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。筛选中引物序列为F-primer：5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’,R-primer：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’,用来扩增。具体方法如下：(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；(2)反筛：将步骤(1)准备的文库与低转移性骨肉瘤细胞株U–2OS和正常骨细胞株hFOB1.19共同孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；(3)正筛：将步骤(2)所得的上清与高转移性骨肉瘤细胞株143B孵育，孵育完成后，洗涤143B细胞，并将143B细胞刮下来，转移至EP管中进行加热变性，之后离心分离，收集上清；(4)PCR富集：将步骤(3)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，PCR扩增所用的引物为:引物F：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’，引物R：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’；(5)单链DNA的纯化：将PCR扩增产物与链霉亲和素包被的琼脂糖球珠孵育，再进行变性解链之后，过滤脱盐，收集到FAM标记的ssDNA，进行冻干；(6)核酸适配体循环筛选：将步骤(5)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)-(5)的筛选过程。本专利技术通过上述方法，获得一条核酸适配体LP4，序列为5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’；本专利技术中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或者人工合成的序列，或任何其他来源的序列；本专利技术中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在检测骨肉瘤细胞转移性中的应用；本专利技术中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在制备高转移性骨肉瘤细胞株143B的探针中的应用；本专利技术中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在制备检测高转移性骨肉瘤的试剂盒中的应用；本专利技术中高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4在涉及和制备治疗高转移性骨肉瘤药物中的应用。与现代技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供了一种高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，目前，国内外尚没有特异性针对高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体，而本专利技术首次提供了高特异性、高亲和力结合高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体，而该核酸适配体可应用于生物医学检测。(2)本专利技术的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，以活细胞为靶标进行筛选，最大限度的保证了靶蛋白的自然属性，所筛选的核酸适配体具有高特异性和高亲和力，无毒，分子量小，易于合成和标记，成本低，周期短，重现性好，在生物医学检测以及靶向治疗方面将有重要的潜在应用价值。附图说明图1为利用流式细胞术分析测定核酸适配体LP4结合高转移性骨肉瘤细胞株143B的解离常数绘制曲线。解离常数Kd=14.44±4.402nM。在图1中，横坐标为DNA浓度（nM），纵坐标为平均荧光强度。图2为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对高转移性骨肉瘤细胞株143B的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图3为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对低转移性骨肉瘤细胞株U-2OS的偏移。在图3中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图4为利用流式细胞术分析核酸适配体LP4对正常骨细胞株hFOB1.19的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞百分比，实线为LP4，虚线为未经筛选的单链DNA文库。图5为核酸适配体LP4的空间结构示意图。具体实施方式本专利技术结合具体实例参见附图进一步说明如下，然而，这些实施例不应视为对本专利技术范围的限制。下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，它的序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，在4℃，0.137MNa+,0.005MMg2+条件下，具有特征性的茎环结构，其空间结构如下：。所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4，对所述的核酸适配体LP4的5’端或者3’端进行FAM、生物素修饰。所述的高转移性骨肉瘤细胞株143B的核酸适配体LP4的筛选方法，基于Cell-SELEX筛选技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U–2OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。利用高转移性骨肉瘤细胞株143B为筛选靶细胞，以与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体LP4特异性结合高转移性人骨肉瘤细胞，其序列如下：5’‑ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体LP4特异性结合高转移性人骨肉瘤细胞，其序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAATGCGTGCGCGGCTCCACGCTATGATTAATTGGACACGGTGGCTTAGT-3’。2.根据权利要求1所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于：在4℃、0.137MNa+、0.005MMg2+条件下的空间结构如下：。3.根据权利要求1所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体，其特征在于：对所述的核酸适配体5’端进行FAM修饰。4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以低转移性骨肉瘤细胞株U-2OS和正常骨细胞株hFOB1.19作为反筛细胞，以高转移性骨肉瘤细胞株143B作为正筛细胞，筛选出与高转移性骨肉瘤细胞株143B特异性结合的核酸适配体。5.根据权利要求4所述的一种用于靶向高转移性人骨肉瘤细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGGACACGGTGGCTTAGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，李佩佩，杨黄浩，王丽萍，陈元胜，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35