一种靶向PD1‑PDL1的双特异性核酸适体及其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向PD1‑PDL1的双特异性核酸适体及其衍生物。本发明专利技术为恶性肿瘤的免疫治疗提供了基于核酸适体的免疫检查点抑制剂。与单抗类的免疫检查点抑制剂相比，核酸适体具有很多优势：无免疫原性，不易失活，容易合成和修饰，能批量生产，能快速的穿透组织和良好的代谢动力学，产品批次间差异小和具有很好的化学稳定性。

A targeted PD1 PDL1 bispecific nucleic acid aptamer and its derivatives

The invention discloses a target nucleic acid PD1 bispecific PDL1 aptamer and its derivatives. The invention provides an immunosuppressive point inhibitor based on an aptamer for the immunotherapy of malignant tumors. Compared with the mono antibody immune checkpoint inhibitors, aptamer has many advantages: no immunogenicity, no easy deactivation, easy synthesis and modification, can batch production, can quickly penetrate tissue metabolism and good products, the difference between the small batch and has good chemical stability.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向PD1-PDL1的双特异性核酸适体及其衍生物
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种靶向PD1-PDL1的双特异性核酸适体及其衍生物。技术背景免疫检查点(immunecheckpoint)是免疫系统中存在的一些抑制性信号通路，通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤，并参与维持对自身抗原的耐受。研究发现，肿瘤细胞会利用免疫检查点的抑制性信号通路抑制T淋巴细胞活性，从而逃避体内免疫系统特别是T淋巴细胞对肿瘤的杀伤效应。重要的免疫检查点分子主要有PD-1、CTLA-4和TIM-3等。程序性死亡蛋白1(programmeddeath1,PD1)是T细胞表面的一种重要的抑制性受体，可诱导性地表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及单核细胞，在静息的淋巴细胞表面无表达。PD1与其配体(PDL1或PDL2)结合时，PD1会减弱T细胞应答。肿瘤细胞通过高表达PDL1分子，与T细胞上的受体PD1结合，传导免疫抑制信号，降低T细胞的增生，导致肿瘤特异性CD8+T细胞的诱导凋亡和免疫无能，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。已经证实，阻断PD1与其配体之一的PDL1之间的相互作用会增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫并且可以因此有助于免疫系统对肿瘤细胞的清除。PD1和PDL1均可作为治疗的靶点，PD1抗体与PD-L1抗体均可阻止二者的相互识别，增强T细胞免疫应答，从而使T细胞能够识别并杀死肿瘤细胞。目前，FDA已经批准了2个针对PD1的单抗药物，而针对PDL1的单抗药物目前也进入了临床III期实验。PD1和PDL1参与的共抑制信号通路中还有其他的配体参与，PD1的配体包括PDL1和PDL2，PDL1的配体包括PD1和B7.1，四者互为配体，双向传递信号。因此，单独针对PD1或PDL1的单靶点药物产生的生物学效应不同，PD1单抗可以完全阻断PD1信号，而PDL1单抗对于T细胞而言不能完全阻断PD1信号，并抑制共刺激分子B7.1；而对于肿瘤细胞或抗原呈递细胞而言会促进其凋亡。因此，开发同时靶向PD1和PDL1的双特异性抑制剂可以完全阻断PD1-PDL1诱导的信号传导及生物学功能，同时阻断单一靶点抑制剂所诱导的代偿机制，降低对单药治疗的耐受性；此外，双特异性抑制剂可以作为媒介重定向免疫效应细胞，增加药物在特异性组织的分布，增强对肿瘤细胞的杀伤功能，减小对健康组织的毒副作用。核酸适体可描述为“化学抗体”。它是通过指数富集的配体系统进化法从DNA/RNA文库中筛选出来的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。通过分子内碱基堆积、疏水、氢键和静电等作用力折叠成独特的分子结构，核酸适体从而高特异性和亲和力识别其靶标分子。相较于基因工程的复杂技术而言，核酸适体不但可以通过自动化的固相合成方法制备，而且可以通过核酸组装和化学交联技术合成制备多功能分子识别探针。同时，核酸适体还具有批次间差异小、无免疫原性、快速的组织通透性等优点。因此，核酸适体作为潜在的治疗药物吸引着研究者的注意。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种靶向PD1-PDL1的双特异性核酸适体及其衍生物和应用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述靶向PD1-PDL1的双特异性核酸适体是含有能特异性与PD1和PDL1结合的核酸适体的核酸适体。优选地，所述双特异性核酸适体序列中含有PD1核酸适体和PDL1核酸适体的单链核酸。优选地，所述双特异性核酸适体序列为SEQIDNO.5至SEQIDNO.12所示序列中的任一种。优选地，所述PD1核酸适体序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。优选地，所述PDL1核酸适体序列为SEQIDNO.3或SEQIDNO.4。上述双特异性核酸适体的衍生物是如下任一种：将双特异性核酸适体序列改造为丙烯酰胺修饰的序列后构建成的核酸适体聚合物；将双特异性核酸适体序列构建成的核酸适体组装体；将双特异性核酸适体序列删除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；将双特异性核酸适体序列部分碱基用天然或人造核苷酸碱基替代后得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；将双特异性核酸适体序列的骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；将双特异性核酸适体序列改造为肽核酸后得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；将双特异性核酸适体序列被聚乙二醇修饰，得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；将双特异性核酸适体与其他药物联用，得到的与所述双特异性核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。上述双特异性核酸适体及其衍生物可以用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，还可以用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物。本专利技术为癌症的免疫治疗提供了一种核酸适体类的免疫检查点抑制剂。与单抗类的免疫检查点抑制剂相比，核酸适体具有很多优势：无免疫原性，不易失活，容易合成和修饰，能批量生产，能快速的穿透组织和良好的代谢动力学，产品批次间差异小和具有很好的化学稳定性。总之，本专利技术基于核酸合成和组装技术首次报道一种同时靶向人PD1蛋白和人PDL1蛋白的双特异性核酸适体。该核酸适体可以同时识别人PD1和PDL1蛋白，并阻断人PD1和PDL1的结合，增强T细胞活性，促进肿瘤细胞凋亡。本专利技术发展的双特异性核酸适体可作为免疫检查点抑制剂，为肿瘤的免疫治疗提供一种新的手段。附图说明图1为双特异性核酸适体的结合能力；图2为双特异性核酸适体的功能考察。具体实施方法以下实施实例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得。实施例1：核酸适体及其衍生物一、核酸适体PD1核酸适体：PD1-7c:CCATCTCCA(SEQIDNO:1)PD1-7oc:CCATCTCCCGTCC(SEQIDNO:2)PDL1核酸适体：Ap3:TAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTC(SEQIDNO:3)Ap3-Trimer:GGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGG(SEQIDNO:4)双特异性核酸适体:Ap3-PD1-7c:TAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTCCCATCTCCA(SEQIDNO:5)Ap3-PD-7c-dimer:TAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTCCCATCTCCACCATCTCCA(SEQIDNO:6)Ap3-PD1-7oc:TAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTCCCATCTCCCGTCC(SEQIDNO:7)Ap3-PD1-7oc-dimer:TAAAGGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGGTAGTTGTTTTTTCTGTTTCCCATCTCCCGTCCCCATCTCCCGTCC(SEQIDNO:8)Ap3-Trimer-PD-7c:GGGCGGGGGGTGGGGTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向PD1‑PDL1的双特异性核酸适体，其特征在于，所述双特异性核酸适体是含有能特异性与PD1和PDL1结合的核酸适体的核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PD1-PDL1的双特异性核酸适体，其特征在于，所述双特异性核酸适体是含有能特异性与PD1和PDL1结合的核酸适体的核酸适体。2.如权利要求1所述的双特异性核酸适体，其特征在于，所述双特异性核酸适体序列中含有PD1核酸适体和PDL1核酸适体的单链核酸。3.如权利要求2所述的双特异性核酸适体，其特征在于，所述双特异性核酸适体序列为SEQIDNO.5至SEQIDNO.12所示序列中的任一种。4.如权利要求2所述的双特异性核酸适体，其特征在于，所述PD1核酸适体序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。5.如权利要求2所述的双特异性核酸适体，其特征在于，所述PDL1核酸适体序列为SEQIDNO.3或SEQIDNO.4。6.如权利要求1所述的双特异性核酸适体的衍生物，其特征在于，所述双特异性核酸适体的衍生物是如下任一种：将双特异性核酸适体序列改造为丙烯酰胺修饰的序列后构建成的核酸适体聚合物；将双特异性核酸适体序列构建成的核酸适体组装体；将双特异性核酸适体序列删除部分核苷酸或增加部分核...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，孙洋，莫柳婷，赵子龙，叶茂，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43