牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体、其应用及其筛选方法，属于生物工程领域。本发明专利技术通过微孔板法不同轮次筛选获得多条G蛋白的核酸适配体候选物，选择测序结果出现频次较高的适配体，用I‑ELAA法测定了其与G蛋白的结合力，五条适配体G‑6、G‑13、G‑39、G‑55和G‑72的KD值分别为34.17±2.1nM、28.33±2.07nM、48.09±1.05nM、32.06±2.27nM和25.27±1.34nM，二级结构预测显示核酸适配体均具有稳定的颈环状或发卡状结构，说明本次筛选的五条适配体均能与G蛋白特异、稳定的结合，可用于后续检测牛呼吸道合胞体抗原或抗体的酶联适配体法的建立。

G protein specific aptamers and screening methods for bovine respiratory syncytial body

【技术实现步骤摘要】
牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体及其筛选方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种牛呼吸道合胞体G蛋白特异性核酸适配体及其筛选方法。
技术介绍
指数富集配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment,SELEX)是一种能获取与靶物质特异结合的寡核苷酸的筛选技术，筛选得到的单链DNA或RNA分子称为核酸适配体。核苷酸不仅有储存和传递遗传信息的作用，还可以通过自身特有的空间结构与其它分子相互作用。在适宜条件下，单链DNA或RNA分子会发生适应性折叠，形成发夹、凸环、四分体等结构，从而与靶物质紧密结合。因此，近年来，具有高特异性、高亲和力、高稳定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特点的核酸适配体，得到了广泛的应用。微孔板法是将靶分子通过物理吸附作用结合于微孔板上，加入适配体文库孵育后弃去未结合的适配体，洗脱与靶分子结合的适配体即可；该方法适用靶分子广，对靶分子性状要求不严格，凡是能特吸附至微孔板的物质均可进行筛选。然而，对于不同的靶物质应采用适当的筛选方法，以便快速、准确地筛选到亲和力高、特异性强的适配体。牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体，其特征在于，所述牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体为序列如SEQ ID NO.5、如SEQ ID NO.6、如SEQ ID NO.7、如SEQ ID NO.8或如SEQ ID NO.9所示的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体，其特征在于，所述牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体为序列如SEQIDNO.5、如SEQIDNO.6、如SEQIDNO.7、如SEQIDNO.8或如SEQIDNO.9所示的任意一种。2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，可连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、纳米发光材料或酶标记。3.如权利要求1所述的牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体在检测牛呼吸道合胞体病毒和抗体方面，及其试剂盒制备的应用。4.一种牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：设计和合成初始寡核苷酸文库及用于PCR扩增的上游引物和下游引物；步骤二，包被：吸取G蛋白溶液包被于微孔板中；步骤三，洗板：甩去包被液，洗涤微孔板，甩干；步骤四，封闭：向微孔中加入含BSA的HEPES液，孵育；步骤五，加核酸适配体文库：甩去封闭液，用HEPEST洗涤，甩干，将溶解的初始寡核苷酸文库加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤六，洗板：甩去寡核苷酸文库，洗涤微孔板，拍干孔中残留的洗涤液；步骤七，洗脱：向微孔中加入核酸洗脱液，孵育；步骤八，提取：吸出洗脱液，提取洗脱液中的核酸适配体；步骤九，PCR：对步骤八提取的核酸适配体分别进行一轮对称PCR和一轮非对称PCR；步骤十，胶回收：回收PCR产物；步骤十一，反筛：从第5轮起开始进行反筛，封闭后，将非对称PCR回收的核酸适配体加入反筛孔，孵育后将上清吸出，加入包被有G蛋白的微孔中孵育。5.根据权利要求4所述的牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤一中所述初始寡核苷酸文库的序列如SEQIDNO.1所示，上游引物的序列如SEQIDNO.2和NO.3所示，下游引物的序列如SEQIDNO.4所示。6.根据权利要求4所述的牛呼吸道合胞体G蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤二中包被具体为：吸取100μLG蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃过夜；步骤三中的洗板具体为：甩去包被液，用300μLHEP...

【专利技术属性】
技术研发人员：王真，曹莉，王家伟，鲁琳，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11