使用解旋酶测定多核苷酸序列制造技术

一种测定多核苷酸序列的方法，包括以下步骤：（ｉ）在适于酶活性的条件下，靶多核苷酸与解旋酶／引发酶（可以是固定化的）反应；（ｉｉ）通过测定辐射，检测酶与靶上的核苷酸之间的相互作用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定多核苷酸序列的方法。
技术介绍
人们对多核苷酸的序列测定有相当大的兴趣。可在WO-A-99/05315中找到一种有效的序列测定方法的简概及描述。专利技术概述本专利技术基于测定电磁辐射可用来检测解旋酶和/或者引发酶的构象和/或者质量变化，当解旋酶和/或者引发酶利用NTP水解产生的能量，将双链DNA(dsDNA)解旋为单链DNA(ssDNA)时，这些蛋白质内可发生构象和/或者质量变化。根据本专利技术，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤(i)在适于解旋酶活性的条件下，将靶多核苷酸与解旋酶/引发酶、NTP源反应(即利用NTP水解产生的能量使DNA解旋)；以及(ii)通过测定辐射，检测经解旋酶的作用特定碱基或者碱基对的分离和/或者邻近。使用解旋酶来测定多核苷酸序列为本方法的成功提供了一些有利条件。首先，减少了多核苷酸分子内存在的二级结构问题，因为解旋酶在其天然环境下，遇到并排除这些结构。其次，解旋酶可在室温下，直接测定双链DNA的序列。解旋酶的这种能力提供了可简化靶多核苷酸操作的有利条件，并提供了对长多核苷酸摸板测序的可能性。通过使用一些技术，可将辐射应用于样本。这些技术包括表面敏感检测技术(其中例如将解旋酶与固相支持物结合)，在固相光学表面上光反应的变化用于指示表面上的结合相互作用。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所用技术为损耗波光谱学，特别是表面胞质共振(surfaceplasmon resonance，SPR)波谱学。专利技术描述在本专利技术的一个实施方案中，解旋酶获得的以NTP方式提供的能量是在严格控制之下的。就是说解旋酶沿着被测序之DNA链的移动是通过直接控制其结合位点区解旋酶分子可获得的能源分子的浓度而调节的。这样使得酶活性可调节，以促进对辐射的测定，从而识别解旋酶或者解旋酶复合体邻近区的一个碱基或者碱基对。另外，由于解旋酶构象的变化可使它进行水解反应和/或沿着多核苷酸移动，可通过控制解旋酶经历构象变化的能力，完成对DNA解旋和测序进展的控制。通过设计(使用当今技术水平的基因操作技术)解旋酶，使该分子含有可使该分子将辐射转变或者转换为构象变化的化学/部分基团，可以实现上述目的。以可确保每一个核苷酸检出的方式对解旋酶活性进行选择性控制。因此本方法是在实时基础上进行的，以获得快速的序列分析。以同样的名称，在同一天提交的共同未决的PCT申请描述了控制的优选方法，其中内容在此处引用作为参考。本方法测定多核苷酸序列时，涉及到对解旋酶与靶多核苷酸之间构象/动力学相互作用的分析。通过监测如果反应进行时电磁或者其它辐射的改变或吸收来测定构象/动力学的相互作用。此处用到的术语“多核苷酸”可以广义解释，包括DNA与RNA，还包括经修饰的DNA与RNA，以及其它的杂合核酸样分子，例如肽核酸(PNA)。此处用到的术语“解旋酶”可以广义解释，它从属于使用或者不使用来自NTP水解的能量将双链多核苷酸解旋为单链多核苷酸的遍在蛋白质(Dean等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1992)26714129-14137；Bramhill等人，细胞(Cell)(1988)54915-918；Schions等人，细胞(1988)52385-395)。二十多年前，发现了第一个解旋酶并对其进行了分类(Abdel-Monem等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)(1976)65411-449 & 65；431-440)。来自原核、真核和病毒系统的新解旋酶不断被发现，并对其特征进行了描述。所有这些分子体系均在本专利技术的范围之内。本专利技术使用的解旋酶可为任何已知类型的解旋酶。可以是任何DNA依赖的DNA解旋酶，例如大肠杆菌(E.coli)DnaB解旋酶(Xiong等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)2597-14)。如果靶多核苷酸是RNA分子，那么解旋酶可以是RNA依赖的解旋酶或者是可以对两种形式的多核苷酸作用的解旋酶。也可以用消化酶，例如外切酶或者拓扑异构酶。在本专利技术的一个优选的实施方案中，解旋酶为噬菌体T7 gp4解旋酶(Egelman等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，(1995)923869-3873)。在本专利技术的一个更优选的实施方案中，解旋酶或者为大肠杆菌RuvB解旋酶(Stasiak等人，美国国家科学院院报，(1994)917618-7622)、大肠杆菌DnaB解旋酶(Xiong等人，分子生物学杂志(1996)2597-14)，或者为猿病毒40大T解旋酶(Dean等人，生物化学杂志(1992)26714129-14137)。至今为止表征的大量解旋酶在其活性形式下显示出为寡聚体，或者可认为情况就是如此。目前，解旋酶是根据其一级结构分类的(Gorbalenya等人，结构生物学最新观点(Current.Opin.Struct.Biol)(1993)3419-429)，但是也可基于寡聚体的状态或者多核苷酸解旋的极性分组(Lohman等人，生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)(1996)65169-214 & Bird等人，结构生物学最新观点(1998)814-18)。大量假定的解旋酶通过与原核生物、真核生物和病毒具序列同源性而得以鉴定(Gorbalenya等人，结构生物学最新观点(1993)3419-429)。虽然许多解旋酶发挥作用的形式似乎为六聚体或者二聚体(Lohman等人，生物化学年鉴(1996)65169-214)，也有一些为单体形式，例如PcrA解旋酶(Bird等人，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)(1998)262686-2693)和NS3解旋酶(Porter等人，生物化学杂志，(1998)27318906-18914)。其它解旋酶，如Rep解旋酶，也可以单体形式存在(Bird等人，核酸研究，(1998)262686-2693)。在本专利技术的一个优选的实施方案中，使用了来自中度嗜热的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的PcrA解旋酶，旨在利用单体系统的操作稳定性。PcrA解旋酶是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Petit等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)(1998)29261-274)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Lordanescu等人，普通分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)(1993)241185-192)的必须酶，它参与了修复和滚环复制(Petit等人，分子微生物学，(1998)29261-274)& Soultanas等人，核酸研究(1999)256350-355)。PcrA与大肠杆菌UvrD和Rep具有较高的同源性。本方法一般应用电磁辐射而进行，使用的是表面胞质共振技术或者核磁共振技术。但是，也可考虑其它测定辐射变化的技术，例如全内反射荧光(TIRF)波谱学、衰减全反射(ATR)波谱学、破坏全反射(FTR)波谱学、布鲁斯特角度反射计、散射全内反射(STIR)或者损耗波椭圆光度法。除了这些需要电磁辐射的技术外，也考虑了其它技术，特别是光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定多核苷酸序列的方法，包括以下步骤：（ｉ）在适于酶活性的条件下，使靶多核苷酸与解旋酶／引发酶反应；（ｉｉ）通过测定辐射，检测酶与靶上的核苷酸之间的相互作用。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DH丹斯哈姆，
申请(专利权)人：医疗生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]