使用加工酶合成多核苷酸的方法技术

本发明专利技术公开一种用于多核苷酸合成的方法，该方法包括下列步骤：（ｉ）在适合于酶活性的条件下使例如聚合酶或ＴｄＴ这样的多核苷酸加工酶与核苷酸底物发生反应；和（ｉｉ）例如使用辐射调整酶的构象以便掺入预定的核苷酸。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于多核苷酸合成的方法。因此，存在对一种合成多核苷酸的改进方法的需求，该方法能够显著增加所合成的多核苷酸的最大长度并提高合成这类多核苷酸的速率。这类方法优选通过自动过程来进行，从而降低了涉及现存方法的复杂性和成本。专利技术概括本专利技术以实现下列情况为基础可以将电磁辐射用于在多核苷酸加工酶内产生构象改变，使得通过对施用于这类酶上的辐射进行控制可以预先测定产生的多核苷酸链的序列。这样能够通过操纵正常体内多核苷酸装配过程而以实时产生“合成的”多核苷酸。本专利技术提供了一种用于合成多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤(i)在合适的条件下使多核苷酸加工酶与核苷酸底物发生反应；和(ii)使所述酶暴露于可控环境(包括辐射)以便影响该酶的三维构象且由此测定/影响产生的多核苷酸的序列。通过应用激光技术将照射施用于加工酶上(通过射线受激发射进行的光增强)特别适用于本专利技术，这是由于这类装置产生的射线的单色和可控特性所造成的。对加工酶构象结构的控制可以通过控制它们起作用的环境来完成。已经证实诸如反应介质的pH和盐含量/浓度这样的条件的改变可以对三维结构产生影响且由此对这类酶系统的活性产生影响(Wong等《生物化学》(Biochemistry)(1991)30526-537)。添加指定的核苷酸和由此产生的合成反应可以通过直接使加工酶产生进行对添加特定核苷酸具有IS特异性的构象改变的能力来完成，这取决于所输送的辐射形式。该过程可以通过下列步骤来实现工程(通过现有技术的遗传操作技术)加工分子(或与之相关的分子)，使得它含有化学/部分/肽基团或基团组，它们能够使所述分子将辐射转化或转换成构象改变。可以对这些化学/部分基团或基团组进行定位以便选择欲添加到伸长的多核苷酸链上的核苷酸。该方法由此可以以“实时”为基础进行以便获得高速率的度核苷酸合成。如上所述，用于合成多核苷酸的本方法包括控制多核苷酸加工酶所置于的环境和由此控制所述酶的三维构象。这种三维构象反过来可选择是否将底物核苷酸和/或将哪一种底物核苷酸添加到伸长的多核苷酸链上。术语“多核苷酸”在本文中用作广义上解释且包括DNA和RNA(包括修饰的DNA和RNA)以及其它杂交核酸样分子，例如肽核酸(PNA)。术语“多核苷酸加工/聚合酶”在本文中用作广义上解释且涉及可以使一种核苷酸与另一种核苷酸连接以便生成多核苷酸的遍在蛋白质。当然，这类酶组包括所有的聚合酶，既包括DNA-和RNA-依赖性聚合酶也包括诸如末端脱氧核苷酸转移酶这样的酶组(Kato等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(1967)2422780；&Frohman等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1988)858998)。使用多核苷酸加工酶来控制多核苷酸的合成对本方法的成功提供了几个优点。首先，因有机分子的高效催化特性而克服了固相合成中反应产率的难题。其次，合成的速度和多核苷酸链的长度大于现有技术几个数量级，这还是由于对酶系统在其天然环境中的要求所造成的。本专利技术的另一个重要方面在于实现了下列情况尽管大量多核苷酸加工酶需要现存的多核苷酸模板以便在其天然环境/形式下引发多核苷酸合成，但是情况并不总是这样。当核苷酸(Crick-Watson)碱基配对和由此产生的互补链构建的有效性最终依赖于加工酶的三维构象(和所得的动力学参数)时，这种系统可以被破坏并应用以便在外部控制所聚合的核苷酸的序列。因此，在本专利技术聚合酶应用的特定情况中，所产生的“合成”多核苷酸链可以不是(且在大多数情况下将不是)模板多核苷酸链的互补拷贝。通过活性位点突变对聚合酶功能的破坏在本领域中是公知的(Freemont等《蛋白质》(Proteins)(1986)166-73)，但关键在于它们不会在构象上/空间上得到调整。如在本专利技术中的情况，这类破坏/突变可以采取降低聚合酶的天然保真性以使它不歧视双脱氧核苷酸的形式。这会使突变的聚合酶将溶解状态的任意核苷酸插入独立于多核苷酸模板的核苷酸序列之外的伸长的多核苷酸链。具有在分子克隆时固定的这类结合位点修饰的性质(即不能够进行外部实时构象调整)在本领域中是公知的(Ollis等《自然》(Nature)(1985)313762-766 & Freemont等《蛋白质》(Proteins)(1986)166-73)且定向于聚合酶活性位点。例如，已经证实大肠杆菌聚合酶I的Phe762是直接与底物核苷酸发生相互作用的氨基酸之一(Joyce等《生物化学年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)(1994)63777-822 & Astake等J.Niol.Chem.(1995)2701945-54)。将这种氨基酸转化成Try可产生不歧视双脱氧核苷酸的突变体DNA聚合酶。参见US-A-5614365和Deb K.Chatterjee于1995年9月8日提交的标题为“突变体DNA聚合酶及其应用”的共同待审美国申请号08/525,087，特别将这些文献引入本文作为参考。后来已经将这些修饰进一步特征化而以降低的误差率限定了聚合酶，即，在核酸合成过程中的核苷酸错掺得到降低和/或聚合的保真性得到增加。参见WO-A-99/10366，特别将该文献引入本文作为参考。该申请涉及一种这类高保真性聚合酶的制备方法，该方法通过修饰聚合酶的核苷酸结合结构域(例如O-螺旋)或使其发生突变来进行。本专利技术方法的一个重要方面在于具有能够通过与光子和/或来源于光子的能量的相互作用得到调整的结构/构象的蛋白质/肽/化学基团/部分的应用。这类基团包括但不限于转换光子能量的生物分子、合成染料化合物和吸收能量的化学基团。本专利技术优选的实施方案包括光子生物换能器在调整聚合酶活性位点(例如O-螺旋)构象和由此调整聚合酶活性中的应用。这组生物换能器包括但不限于集光(LH)复合体/分子和涉及光合成的系统(例如诸如LH1和LH2这样的细菌复合体；参见Papiz等《植物科学趋势》(Trends Plant Sci.)(1996)1198-206)、直接光子驱动的质子泵复合体/亚单位(例如来自盐沼盐杆菌紫膜的紫膜质(BR)；参见Oka等《生物物理学杂志》(Biophy.J.)(1999)761018-1023)、感觉色素(例如视黄醛和相关蛋白质复合物)和天然荧光蛋白质及工程衍生物(例如绿色荧光蛋白(GFP)；Heim等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1994)9112501-12504)。影响总体功能和为本专利技术中可控构象调整靶向的聚合酶分子活性位点包括但不限于O-螺旋、K-螺旋和Taq DNA聚合酶的内O-P环或其它聚合酶中类似的位置；参见WO-A-98/40496。一般“融合”序列和由此“融合”两种或多种肽/蛋白质的结构的方法在本领域中是众所周知的且就绿色荧光蛋白(GFP)而言已经广泛用于构建融合突变体或“变色”(chameleon)蛋白质以便生成诸如Ca2+这样的特异性底物的荧光标记并调节光谱反应(Heim等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1997)388882-887)。在一个优选的实施方案中，使T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于多核苷酸合成的方法，该方法包括下列步骤：（ｉ）在适合于酶活性的条件下使多核苷酸加工酶与核苷酸底物发生反应；和（ｉｉ）调整所述酶的构象以便掺入预定的核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DH丹斯哈姆，
申请(专利权)人：医疗生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]