一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种固相载体上校读ＰＣＲ检测基因突变的方法，设计引物，经二硫化物和磷酸修饰处理后，固定于普通载玻片，进行固相ＰＣＲ反应；在ＰＣＲ过程中，利用ＤＮＡ多聚酶的３’－５’外切酶活性，实现突变基因的固相有效扩增，ＰＣＲ过程中掺入生物素，扩增产物用酶标方法进行原位检测。本发明专利技术可对同一基因多个突变发生位点进行同步检测，对多个不同基因的基因突变情况进行检查，检测速度快，灵敏度高，操作简便，成本低，可用于细菌耐药性、遗传病等的临床检测。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种固相载体上校读ＰＣＲ检测基因突变的方法，它包括下列步骤：Ａ．根据目标基因，设计一对外引物和内引物，后者与基因突变热点相对应，对内引物的两个末端分别进行二硫化物和磷酸化修饰；Ｂ．对普通载玻片进行巯基硅烷化修饰，固定突变热点对应引物 ；Ｃ．选用ｐｆｕ高保真ＤＮＡ多聚酶，优化反应条件为：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３，２０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，５０μＭ ｄＮＴＰｓ；使酶的外切酶活性达到最佳；Ｄ．使用高保真酶，以 外引物为液相引物，以临床样品为模板，在相同条件下对内引物进行固相半巢式ＰＣＲ，特异性扩增突变位点对应内引物，在扩增过程中掺入生物素；Ｅ．运用酶标技术，对扩增结果进行原位信号检测，封阻液进行室温封阻１５分钟，甩干，亲和素标记碱性磷酸酶室温 作用１５分钟，漂洗液漂洗两次，１５分钟／次，底物缓冲液漂洗５分钟，甩干，加底物ＮＢＴ／ＢＣＩＰ，３７℃显色３０分钟。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张先恩，邓教宇，张治平，文继开，陆红兵，刘强，刘虹，谢卫红，谢斌，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]