中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用制造技术

中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用，属于分子生物学技术领域。重组表达方法包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定，其中重组载体构建是根据已克隆到的对虾素成熟肽的ｃＤＮＡ序列，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括ｐＥＴ系列、ｐＧＥＸ－４Ｔ系列、ｐＰＩＣ系列、ｐＡＯ８１５和杆状病毒表达载体；再将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株或细胞并诱导表达。表达产物可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因工程
中重组表达和纯化等技术，具体涉及对虾抗菌肽(对虾素)基因表达、表达产物纯化与活性测定等技术，属于分子生物学
抗菌肽是20世纪70年代研究昆虫免疫系统时发现的一类具有抗菌特性的小分子多肽。昆虫抗菌肽具有分子量小、热稳定高、水溶性好、杀菌力强、抗菌谱广等优点，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，而对正常真核细胞无毒害作用。这就使得研究人员对抗菌肽产生了浓厚的兴趣，并在诱导释放、抗菌机理、结构功能、重组表达等各个方面进行了深入的研究。水产养殖品种生活于富含各种各样微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能。抗菌肽被认为是鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一。对水产养殖品种抗菌肽的分离纯化并研究其结构与功能，进而通过基因工程技术在原核细胞、真核细胞或某些藻类中重组表达，将有希望成为对付水产养殖品种主要病原菌特别是耐药菌或病毒的新型药物。同属甲壳纲的虾类抗菌肽的研究起步较晚。法国贝车瑞(Bachere)教授实验室对凡纳对虾抗菌肽(对虾素)进行了系统研究1997年他们从养殖的凡纳对虾(Penaeusvannamei)的血细胞和血浆中分离了3种抗菌肽，称为对虾素1，2和3(penaeidin-1，2 and 3)，具有抗真菌、细菌尤其是革兰氏阳性菌的活力，参见戴斯特谬克司等的“对虾素-从凡纳对虾分离得到的抗菌肽的一个新家族”，刊于生物化学杂志，1997年272卷，28398-28406页(Destoumieux D，Bulet P，Loew D，et al.Penaeidins，a new familyof antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda).J.Biol.Chem.，1997，27228398～28406)。戴斯特谬克司-卡森等又在凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)和南美白对虾(Litopenaeus stylirostris)中发现了具有严格抗真菌活性的3种于阴离子抗菌肽。该文的题目为“微生物诱导产生的来自对虾血蓝蛋白C-末端的的抗真菌肽”发表在生物化学杂志2002年276卷47070-47077页(Destoumieux-Garzon D，Saulniner D，Garnier Jet al.Crustacean Immunityantifungal peptides are generated from the c terminus of shrimp hemocyanin inresponse to microbial challenge.J.Biol.Chem.2001，276，47070-47077)。戴斯特谬克司将编码对虾素成熟肽的基因克隆到PCRscript SK(+)载体，并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，进行表达和抗菌活性分析，发现基因工程合成的抗菌肽与天然抗菌肽在结构上虽有差异，但活性相似。参见戴斯特谬克司等刊于欧洲生物化学杂志1999年266卷第335-346页的文章，题目为“来自对虾的抗菌肽，对虾素的重组表达和活性研究”(Deatoumieux D，Bulet P，Strub J M，et al.Recombinantexpression and range of activity of penaeidins，antibacterial peptides frompenaeid shrimp.Eur J Biochem，1999，266335～346)。我们利用RT-PCR和末端快速扩增等方法，从中国对虾血细胞中克隆得到1种对虾素(Penaeidins)家族的抗菌肽Ch-penaedin基因(chp)，见康翠洁，王金星，赵小凡，相建海，2002，中国对虾抗菌肽成熟肽cDNA克隆，山东大学学报(理学版)37(6)552-556，并对其表达和性质进行了系统研究。申请号02109931、公开号1381587的专利文献也公开了克隆到的对虾抗菌肽的cDNA序列。根据克隆得到的对虾素基因，分别构建原核和真核表达载体，利用大肠杆菌、酵母菌和昆虫细胞表达系统分别表达了有活性的抗菌肽(对虾素)，建立纯化方法和活性鉴定方法。本专利技术中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定。分别说明如下1.重组载体构建根据已克隆到的对虾抗菌肽成熟肽的cDNA序列(申请号02109931，公开号1381587)，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和杆状病毒表达载体。2.转化与筛选将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株并诱导表达。3.表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定采用诱导剂诱导表达工程菌，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用层析的方法纯化抗菌肽，并测定抗菌谱。上述的诱导剂是原核表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，简称IPTG，酵母表达的诱导剂是甲醇。上述特异性引物是下列之一(1)以重组质粒chp/pGEM T-easy为模板，以chppGEXF/chppGEXR为引物，引物两端加EcoR I和Xho I酶切位点，扩增对虾抗菌肽成熟肽基因chp，引物序列为ChppGEX F 5’GCGC GAA TTC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChppGEX R 5’GCGC CTCGAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’。(2)以对虾Chp/pGEM T-easy质粒为模板进行PCR扩增，两条引物分别为F 5’CTGGGAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位点，R 5’TCGG GCG GCC GC ACTTAC ATC CCA CATG 3’加Not I位点。(3)以chp/pGEM-T easy为模板，以ChpBac F ChpBac R为引物扩增对虾素基因，引物序列为ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChpBac R5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物两端加Bam H I和Xho I酶切位点。本专利技术在大肠杆菌、酵母菌和昆虫细胞中分泌表达了有活性的抗菌肽。用本专利技术重组表达的对虾抗菌肽(对虾素)进行抑菌实验，表明对虾素对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌等革蓝氏阴性菌和阳性菌有抑菌活性。本专利技术表达产物可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。PCR反应体积25μl，扩增条件94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循环；72℃10min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测得到大约350bp左右的扩增产物。用胶纯化试剂盒纯化所得的产物。2)m-chp-pGEX-4T-1重组质粒的构建载体pGEX-4T-1和纯化的PCR产物(m-chp)分别用Ec本文档来自技高网...

【技术保护点】
中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定其特征在于，所述的重组载体构建是：根据已克隆到的对虾素成熟肽的ｃＤＮＡ序列，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括ｐＥＴ系列、ｐＧＥＸ－４Ｔ系列、ｐＰＩＣ系列、ｐＡＯ８１５和杆状病毒表达载体；所述的转化与筛选是：将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株或细胞并诱导表达；所述的表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定是： 采用诱导剂诱导表达的工程菌，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用层析的方法纯化抗菌肽，并测定抗菌谱。

【技术特征摘要】
1.中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定其特征在于，所述的重组载体构建是根据已克隆到的对虾素成熟肽的cDNA序列，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和杆状病毒表达载体；所述的转化与筛选是将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株或细胞并诱导表达；所述的表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定是采用诱导剂诱导表达的工程菌，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用层析的方法纯化抗菌肽，并测定抗菌谱。2.如权利要求1所述的中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，其特征在于，所述的诱导剂是原核表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，酵母表达的诱导剂是甲醇。3.如权利要求1所述的中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，其特征在于，所述特异性引物是下列之一(1)以重组质粒chp/pUCM-T为模板，引物chppGEXF/chppGEXR，引物两端加EcoRI和Xho I酶切位点，扩增虾防御素成熟肽基因chp，引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金星，赵小凡，相建海，李富花，
申请(专利权)人：山东大学，中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]