荧光PCR定性检测含有Bar基因转基因作物探针序列及试剂盒制造技术

一种荧光ＰＣＲ定性检测含有Ｂａｒ基因序列转基因作物探针序列及试剂盒，所述的探针序列包括：序列ＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧ向上游延伸５个碱基、向下游延伸５个碱基的区域内形成的序列。所述的试剂盒组成为：核酸提取试剂；核酸扩增试剂，该试剂包括：ＢａｒＰＣＲ反应液、１８ｓ－ｒＲＮＡ反应液、Ｔａｑ酶（５Ｕ／ｕｌ）、ＵＮＧ（１Ｕ／ｕｌ）；对照品等，本试剂盒对于转入Ｂａｒ基因序列转基因作物检测灵敏度可达０．１％，本试剂盒具有良好的特异性。由于本试剂盒采用了植物内源基因１８Ｓ－ｒＲＮＡ作为内标，避免了假阴性的产生，由于本方法对ＰＣＲ产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种荧光PCR定性检测含有Bar基因转基因作物探针序列及试剂盒。
技术介绍
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。在目前所见到的转基因作物中，转入的目的基因种类繁多，功能各异。为了使转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列，统计表明，35S启动子，FMV启动子，nos终止子，nptII，cry3A，bar和pat这七种基因片段，用做筛查目的靶核苷酸序列时则可覆盖绝大多数的GMO品种。(详见附录一商品化的转基因作物品种含有的定性筛选基因)。Bar基因来源于链霉菌Streptomyces hygroscopicus或Streptomyces viridochromogenes，是一种酶基因“the enzyme phosphinothricin acetyltransferase(PAT)。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要提供一种荧光PCR定性检测含有Bar基因转基因作物探针序列及试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案所述的荧光PCR定性检测含有含有Bar基因转基因作物探针序列包括序列CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。上游引物ACAAGCACGGTCAACTTCC，下游引物ACTCGGCCGTCCAGTCGTA. 所述的试剂盒组成为核酸提取试剂核酸扩增试剂BarPCR反应液(定性)18s-rRNA PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)纯化水对照品Bar阳性对照品18s-rRNA阳性对照品基因组全序列见附录二核酸提取试剂与提取方法相关，可使用传统的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(CatFF3750，200tests)。本专利技术的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物、一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。同时结合荧光探针检测技术，该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合，随着PCR过程的进行，荧光信号发生相应的变化，使用在线监测的荧光PCR检测仪，即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测，根据收集记录的荧光信号，判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。为排除假阴性的出现，本试剂盒系列还包括植物共有的18s-rRNA基因检测系统，用于检测样本DNA的提取和PCR反应过程。附图说明图1荧光PCR定性检测含有Bar基因转基因作物扩增图阳性样品为0.1％玉米，2、为转基因油菜种子，3、为Cry9c玉米。阴性样品为美国大豆，0.1％Fluka大豆标准品，0％玉米。图1中，1、为0.1％玉米，2、为油菜种子，3、为Cry9c玉米。具体实施例方式引物、探针设计对GMO中选用的多种Bar基因一序列(包括Bar的天然序列以及人工改建序列)进行比较，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根据上述原则设计出的引物、探针如下上游27u，46u，89u，116u，129u 159u，195u，332u，336u，383u，408u，438u，479u，491u，518u下游198r， 278r， 396r， 488r， 498r， 506r，578r探针BAR143tdB，BAR 228fb，BAR 422fb，BAR 467fb，BAR 548fb最优引物、探针序列如下引物上游引物Bar 129uACAAGCACGGTCAACTTCC下游引物Bar 278rACTCGGCCGTCCAGTCGTA探针序列BAR143tdBFam-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG-TAMRA反应体系的建立及优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得用已确认的转入该基因的转基因油菜籽为材料，以Promega Purification kit提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物进行PCR扩增。扩增产物用1×TE进行10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5个稀释度为系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光ＰＣＲ定性检测含有Ｂａｒ基因转基因作物探针序列，其特征在于：所述的探针序列包括：序列ＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧ向上游延伸５个碱基、向下游延伸５个碱基的区域内形成的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文斯，朱水芳，黄茜华，
申请(专利权)人：深圳市匹基生物工程股份有限公司，国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]